文档介绍：大肠杆菌感受态细胞的制备
一、实验目的
通过本实验,掌握大肠杆菌感受态细胞的制备的方法和技术
二、实验原理
处于对数生长期的细菌经CaCl2处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,接受外源DNA的能力显著增加。细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态
在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
CaCl2法制备的感受态细胞简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法使用广泛
三、仪器、材料与试剂
超净工作台
冷冻离心机
恒温摇床
15mL移液管

大肠杆菌DH5α

四、实验步骤
受体菌的培养
感受态细胞的制备
感受态细胞的分装与冷冻
1、受体菌的培养
DH5α单菌落,接种于3~5mL LB液体培养基中,37℃下振荡培养过夜(12h)
将该菌种悬液以1:100的比例接种,取250μL菌液转接到25mL LB液体培养基中,37℃振荡培养2~3h至OD600=
2、感受态细胞的制备
吸取4mL菌液转入15mL离心管中,冰上放置10min
在4℃下,4000r/min离心10min,,冰上放置30min
0~4 ℃4000r/min离心10min,弃去上清,,轻轻悬浮细胞,冰上放置
将此感受态细胞分装成每份100μL( Eppendorf管),4 ℃冰箱保存3h备用,每人至少一支
(或者在2mL制备好的感受态细胞中加入2mL30%甘油,将此感受态细胞分装成每份100μL( Eppendorf管),快速转入-70 ℃冰箱保存)本次实验不采用
以上操作在超净工作台完成
五、思考题
怎样制备大肠杆菌感受态细胞?如何获得适合用于制备感受态的菌体细胞?
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