文档介绍：大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法
时间:2010-02-26 11:19:12 来源:丁香园作者: 点击: 1012次
常态的细胞不能摄入外部溶液中的DNA,所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。受体细胞经过一些特殊方法(如:CaCl,RuCl等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生变化,petent cell) 。
转化,是将异源DNA分子引入一细胞株系,使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段,是基因工程等研究领域的基本实验技术。进入细胞的DNA分子通过复制表达,才能实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。
α-互补现象:因为许多载体都带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息,编码α-互补肽,该肽段能与宿主编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补( α-互补)。当这种载体转入可编码?-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时,在异丙基-?-D硫代半乳糖苷(IPTG)的诱导下,宿主可同时合成这两种肽段,虽然它们各自都没有酶活性,但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所以称这种现象为α-互补现象。由互补产生的α-半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落,所以利用这个特点,在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点,当插入一个外源DNA片段时,会造成LacZ(α)基因的失活,破坏α-互补作用,就不能产生具有活性的酶。所以,有重组质粒的菌落为白色,而没有重组质粒的菌落为蓝色。
大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法:
方法一:
细菌转化的方法多以Mendel和Higa(1970)的发现为基础,其基本方法是用冰预冷CaCl2或多种2价阳离子等处理细菌,使之进入感受态得以转化。用CaCl2制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞,常用于成批制备感受态细菌。本法适用于大多数大肠杆菌菌株,且迅速、重复性好。
实验步骤:
1、从37℃培养16~20h的新鲜平板中挑取一个单菌落(如大肠杆菌DH52),或1ml新鲜的16~20h过夜培养物,转到一个含有100mlLB培养基的1L或500ml烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养约2~3h(旋转摇床200~300r/min),每隔20~30min测量OD600值≈。
2、在无菌条件下将细菌转移到一个,用冰预冷的50ml聚丙烯离心管中,在冰上放置10~20min。
3、于4℃用SorvallGS2转头(或与其离心管相配的转头)以4000r/min离心10min,以回收细胞。
4、倒数培养液,将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。
5、,放于冰上。4 h
6、于4℃用SorvallGS3转头(或与其相应的转头)以4000r/min离心10min,以回收细胞。
7、倒出培养液,将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。
8、 CaCl2重悬每份沉定,此时,可以迅速将细胞分装成小份,液氮中冰冻,-70℃贮存备用。
9、用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中,每管加DNA或连
接反应混合物(体积≤10μl,DNA≤50ng),轻轻旋转以混匀内容物,在冰中放置30min。
10、将离心管放到预加温到40℃的循环水浴中的试管架上,放置90s~2min,不要摇动试管。
11、快速将管转移到冰浴中,使细胞冷却1~2min。
12、每离心管加800μlSOC培养基,用水浴将培养基加温到37℃,然后将管转移到37℃摇床上,温育45min使细菌复苏,并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。
13、将适当体积(每个90mm平板可达200μl)已转化的感受态细胞转移到含200mmol/l MgSO4和相应抗生素的SOB培养基上
14、将平板置于室温至液体被吸收。
15、倒置平皿,于37℃培养,12~16h后可出现菌落。
方法二:
CASsuper One-petent Cell Preps Kit 采用一种简单便捷的方法处理大肠杆菌,使其成为感受态细胞,便于质粒DNA的转化,可满足一般实验的要求。与CaCl2法相比具有多种优点:使用方便,只需一步即可完成感受态细胞的制备;转化效率略高于CaCl2法,一般可达106-108cfu/μg,满足一般实验需要;感受态细胞制成后即可保存于-70℃,无须加入甘油,并且经长期保存活力无明显下降。
1、从液氮或低温冰箱中取出的大肠杆菌冻存菌,在LB平板上划线,37度过夜至长出单菌落。挑形态饱满