文档介绍：实验目的
染色原理
染色方法
实验材料
实验内容与步骤
注意事项
实验结果
一、实验目的
1. 学****微生物涂片,染色原理和染色的基本操作技术,从而掌握微生物的一般染色法和革兰氏染色法。
2. 巩固显微镜(油镜)的使用方法和无菌操作技术。
二、染色原理
由于微生物细胞含有大量水分,对光线的吸收和反射与水溶液的差别不大,机体是无色透明的,与周围背景没有明显的反差,在普通光学显微镜下不易识别,必须对它们进行染色,使经染色后的菌体与背景形成明显的色差,从而能更清楚地观察到其形态和结构。
微生物细胞是由蛋白质、核酸等***电解质及其他化合物组成。所以,微生物细胞表现出***电解质的性质。***电解质兼有碱性基和酸性基,在酸性溶液中离解出碱性基呈碱性带正电。在碱性溶液中离解出酸性基呈酸性带负电。
经测定,细菌等电点pH在2-5之间,故在中性、碱性或偏酸性溶液中,细菌的等电点均低于上述溶液的pH值,所以细菌带负电荷,容易与带正电荷的碱性染料结合,故用碱性染料染色的较多。微生物体内各结构与染料结合力不同,故可用各种染料分别染微生物的各结构以便观察。
三、染色方法
(一)简单染色法
简单染色法又叫作普通染色法,只用一种染料使细菌染上颜色,如果仅为了在显微镜下看清细菌的形态,用简单染色即可。
(二)复染色法
用两种或多种染料染细菌,目的是为了鉴别不同性质的细菌,所以又叫鉴别染色法。主要的复染色法有革兰氏染色法和抗酸性染色法。
革兰氏染色法:不仅能观察到细菌的形态,而且还可将所有细菌区分为两大类:染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌,用G+表示;染色反应呈红色(复染颜色)的称为革兰氏阴性细菌,用G-表示。细菌对革兰氏染色的不同反应,是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。
五、实验内容与步骤
(一)细菌的简单染色步骤
涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检

取干净的载玻片于实验台上,在载玻片的中央滴一滴无菌蒸馏水,将接种环在火焰上烧红,待冷却后从斜面挑取少量菌种(表皮球菌或变形杆菌)与玻片上的水滴混匀后,在载玻片上涂布成一均匀的薄层,涂布面不宜过大。

涂片最好在室温下使其自然干燥,有时为了使之干得更快些,可将标本面向上,手持载玻片一端的两侧,小心地在酒精灯上高处微微加热,使水分蒸发,但切勿紧靠火焰或加热时间过长,以防标本烤枯而变形。

固定常常利用高温,手持载玻片的一端,标本向上,在酒精灯火焰外层尽快的来回通过2~3次,共约2~3秒钟,并不时以载玻片背面加热触及皮肤,不觉过烫为宜(不超过60℃),放置待冷后,进行染色。

在涂片薄膜上滴加染色液(石炭酸复红、草酸铵结晶紫或美蓝任选一种)一滴,使染色液覆盖涂片,染色约1min。

斜置载玻片,在自来水龙头下用小股水流冲洗,直至洗下的水呈无色为止。

用吸水纸吸去涂片边缘的水珠,置于室温下自然干燥。用吸水纸时切勿将菌体擦掉。

用显微镜观察,并用铅笔绘出细菌形态图。
(二)细菌的革兰氏染色步骤
涂片→干燥→固定→初染→水洗→媒染→水洗→脱色→水洗→复染→水洗→干燥→观察
(均以无菌操作)分别在同一张载玻片上做涂片、干燥、固定,方法均与简单染色的相同。
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,滴加95%乙醇脱色,至流出的乙醇不现紫色为止,大约需时20~30s,随即水洗。
,水洗。
,待标本片干后置显微镜下,用低倍镜观察,发现目的物后用油镜观察,注意细菌细胞的颜色。绘出细菌的形态图并说明革兰氏染色的结果。