文档介绍：多酚氧化酶的研究
简介
多酚氧化酶(polyphenol oxidase,简称PPO)、品质等密切相关,人们很早就开始对它进行深入细致的研究.
铜是酶的活性中心,从蛋白质中除去一部分或全部铜,将引起酶活性下降或完全失活,若添加铜的话,酶活又能恢复。不同果蔬中的PPO铜辅基的数量会有所不同,如蘑菇中PPO含4个铜原子,而扁豆的PPO含1个铜原子。
现在PPO的应用多用于提高植物对病原菌的抗性。
PPO与一些水果和作物的褐化有关。PPO是决定红茶品质的关键酶类。在啤酒生产过中,PPO与啤酒风味陈化紧密相关。反之,为了防止水果褐化,保持水果新鲜,生产上也运用多种方法降低水果中PPO活性和含量。
提取和纯化
制备***粉( 4℃)
- 30℃的果实解冻与***-蒸馏水混合粉碎抽滤滤渣用-30 ℃的***冲洗滤渣既为***粉室温下晾干。
活性酶的提取
用磷酸缓冲液将***粉溶解
离心沉淀再用磷酸缓冲液提
取1次合并2次离心后上清液
浓缩粗酶
(NH4)2SO4分级沉淀
(NH4)2SO4按质量浓度进行9个分级加入粗酶液中 0℃下静置离心上清液再加入下一级的(NH4)2SO4浓度(重复操作,测定每次沉淀的酶活性和蛋白含量)
PPO的纯化常采用盐析法。盐析主要是利用酶蛋白在高浓度的盐溶液中溶解度减小而析出的原理。硫酸按由于价廉、溶解度大,且能使蛋白质稳定,故是最常用的盐析剂。
多酚氧化酶的SDS-PAGE电泳纯度鉴定、分子量测定
常用SDS-PAGE电泳对多酚氧化酶
的纯度和分子量进行测定,并推
测同工酶的数量。
葡聚糖凝胶
文献报道植物组织中PPO分子量一般介于40-70K之间,根据葡聚糖凝胶分离大分子的原理,葡聚糖凝胶分离PPO与杂蛋白。不同型号凝胶的分离范围是根据球形蛋白理论模型确定的,而实际分离蛋白的结构与理论模型常有较大差异,因此在纯化PPO时,采用不同型号的葡聚糖凝胶进
行分离效果的比较。