文档介绍：实验一实验一:: 鸡胚原代成纤维鸡胚原代成纤维
细胞的制备与培养细胞的制备与培养
一、实验目的
•掌握鸡胚原代成纤维细胞的制备及培养的
基本步骤;
•掌握活细胞的显微镜下观察;
•熟悉病毒在细胞内增殖的基本判断方法。
二、实验原理
•离体动物组织通过温和的手段(机械和酶消化)
形成单个细胞后,在适宜的外界环境中,包括温
度、酸碱度和气相环境,并给予充足合适的营养
条件,能生存、生长形成单层细胞,这种原代培
养的细胞具有原来体内所具备的基本特性,比如
肌肉细胞的收缩功能;上皮细胞的分泌功能等。
通常把这种从体内取出组织细胞开始培养到第一
次进行传代之前的这一段时期称为原(初)代培养。
原代细胞最接近体内细胞的特性,因而对外界环
境的变化也最敏感,因此比较适合病毒的增殖,
药物的作用机制等的研究。
三、实验材料(2人/组)
• 9~11日龄鸡胚1只,碘酒和酒精棉球若
干,无菌器械一套,无菌无毒平皿2只;
• 5或10ml吸管4支,1或5ml吸管1支,长青
霉素瓶2只(带塞);
• Hank’s液1瓶,RPMI-1640或DMEM 1瓶,
双抗1瓶(5ml);
•胰蛋白酶1瓶(1ml),血清1瓶(5ml),
%NaHCO3 1瓶
四、操作步骤
• 1、碘酒和酒精棉球分别拭擦鸡胚气室外卵
壳;
• 2、取出两只无菌平皿,并标记①和②,待
用。
• 3、在RPMI-1640和Hank’s 液中分别无菌
操作以1%的量加入双抗,吸出10~15ml
Hank’s 液至无菌平皿中备用;
• 4、大镊子轻敲卵壳顶部然后小心去掉气室
外卵壳;
• 5、消毒镊子后小心撕破卵膜,两人互相配合取出
鸡胚置于盛有Hank’s 液的平皿①中,小心去头、
内脏、爪和粘液及血球,洗涤后置于盛有Hank’s
液的平皿②中,再充分洗涤;
• 6、取出洗净的组织块置于大青霉素瓶中,在火焰
~1mm3的小
块(约250次),;用Hank’s液
洗涤两次。
• 7、加入1 ml 1%胰蛋白酶,用适量Hank’s液调
%,%NaHCO3调节pH
~(肉眼观为肉红色,1 ml吸管约3滴)
盖上瓶塞,写好标记;
• 8、将上述细胞瓶置于37℃水浴中,开始计时,
约15~30min,其间缓慢摇匀以充分消化。消化
停止的标志是:轻轻晃动后细胞悬起,呈云雾
状,很快聚集成团,表明细胞活力好。
• 9、消化结束后,取出,稍沉淀,缓慢吸出上清,
用Hank’s 液小心洗涤2~3次,可以尽量减少胰
蛋白酶的残留量,然后加入RPMI-1640液约
5ml,用小头吸管充分吹打,使细胞充分分散。
吸上清;重复操作3~4次,收集细胞上清。
• 10、上述细胞悬液自然沉降,待未消化彻底的组
织块沉入瓶底后,收集上清,并加入足量的小牛
血清(终浓度为10%)。
• 11、将上述制备好的细胞悬液平均分配到
两个细胞瓶中,5ml/瓶,塞好螺口塞,注
意生长面朝下,在非生长面上做好标记,
包括细胞名称,接种培养时间,组别及姓
名等。
• 12、细胞统一置于本室指定的37℃,5%
CO2孵箱中培养。
• 13、24h后观察细胞生长情况,如果细胞长
成单层,细胞界限清晰,大多数细胞为梭
形并贴壁,布满细胞瓶的生长面,说明细
胞生长状态良好。
实验二实验二:: 滤泡滤泡性性口炎口炎病毒病毒
((VSVVSV)的增殖()的增殖(纯纯培养)培养)
一、实验目的
•掌握病毒在细胞内增殖的基本判断方法。
二、实验原理
•原代细胞最接近体内细胞的特性,因而对外界环
境的变化也最敏感,因此比较适合病毒的增殖,
药物的作用机制等研究。病毒在细胞内增殖的检
测指标有细胞变化、红细胞吸附、细胞代谢改变、
干扰现象、免疫荧光法检测等。由病毒引起的细
胞病变称细胞病变效应(cytopathic effect,
CPE),常见的细胞形态学变化为细胞变圆、聚
集、融合、裂解或脱落等。