文档介绍：第七章
细胞培养中的基本方法
一、细胞培养操作基本要领和要求
防止污染是决定培养成败的首要条件。
培养前准备准备各种所需物品(宁多勿
少);用品置于场地,然后消毒
操作野消毒
现多用紫外线灯灭菌,效果很好。
洗手和着装
洗手用75%%的新洁尔灭
火焰消毒
在无菌环境进行培养或做其它无菌
操作时,首先要点燃酒精灯。以后
一切操作,如安装吸管帽、启开或
封闭瓶口等,都需要经过火焰烧灼
进行。
培养操作
动作准确敏捷
不用手触及已消毒物品
操作面布局合理
操作保持一定顺序
组织或细胞在未做处理前或培养液在未用前,勿过早暴露在空气中;用过之后如不再重复使用,应立即封闭瓶口。
防止各种用液的交叉污染
不向操作野讲话或咳嗽
二、细胞计数
用细胞计数法测定细胞生长动力学是
目前采用的最普遍的方法。
血细胞计数板人工计数
细胞计数器
血细胞计数板:常用的是改良的纽巴氏
(Neubauer)血细胞计数板。
具体操作程序如下:
1、取血细胞计数板和盖玻片,用75%酒精擦净。将盖玻片放于计数板上。
2、用滴管取混合均匀的细胞悬液,滴入计数室内。要保证盖片下充满悬液,注意盖片下不要有气泡,也不能让悬液流入旁边槽中。滴加细胞悬液后约静置1分钟后则可以进行计数。
3、统计四个大格的细胞数:将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察,并移动计数板,分别数出四角的四个大格(每个大格含有16个中格)中的细胞数。
对压边线细胞:计上不计下,计左不计右
计算:一般以每毫升含细胞数来表示
大方格的面积为1mm2,,。×104,才为1ml体积。所以计算公式为:
细胞悬液的细胞数)/ml
=( 四个大格子细胞数/4) ×104 ×稀释倍数
计数中,如果细胞悬液的细胞浓度过高,必须稀
释后再计;如果细胞数太少,可离心浓缩后再计。
每个细胞悬液至少滴样两次求平均值。
用细胞计数板计数时应注意的事项:
﹙1﹚不要漏计,不要重复
﹙2﹚细胞悬液应混合均匀
﹙3﹚浓度不可过高也不可过低。
三、细胞生长曲线的绘制
细胞生长曲线(cell growth curve)是观测细胞在一代生存期内的增生过程的重要指标,可根据细胞生长曲线分析细胞增殖速度,确定细胞传代、细胞冻存或具体实验的最佳时间。
它以培养时间为横坐标、细胞密度为纵坐标作坐标图。