文档介绍：实验七酶联免疫吸附试验
山东师范大学生命科学学院杨桂文
一、实验目的
掌握酶联免疫吸附实验的操作过程和原理。
二、实验原理
ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相
载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性,酶标记的抗原或抗体既保留其
免疫学活性,又保留酶的活性。在测定时,受检标本(测定其中的抗体或抗
原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成
的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体,
也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量
呈一定的比例。加入酶反应的底物后,底物被酶催化成为有色产物,产物的
量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据呈色的深浅进行定性或定量分
析。由于酶的催化效率很高,间接地放大了免疫反应的结果,使测定方法达
到很高的敏感度。
三、实验材料
聚乙烯塑料酶标板()
抗原:伤寒杆菌O901煮沸或超声波粉碎抗原
待测血清
冻干酶联葡萄球菌A蛋白(HRD—proteinA)纯品
邻苯二胺(OPD)
包被液:—
稀释液:10%免疫血清PBS—吐温20,防止非特异性吸附
洗涤液: ,
底物溶液:, ,蒸馏水50毫升。临用前新鲜配制,在上述缓冲液中溶解40毫克邻苯二胺,然后加入30%,底物对光敏感,需要避光并立即使用。
终止液;2M硫酸
四、实验步骤

取洁净的聚苯乙烯微量反应板,于每孔内加伤寒抗原
(用包被缓冲液稀释,蛋白含量10微克/毫升),
置37℃1小时,弃抗原液,用洗涤液3次每次3分钟。

于每孔内分别加不同稀释度(如1:5,1:10,1:
20…1:80)的待测血清,PBS空白对照,阴性对照血
清,。置37℃30分钟,洗涤3次。

,置37℃20分钟,洗涤
3次。

,置暗处15分钟。
加2M碳酸1滴终止反应。

以酶标仪测定492nm处的光吸收。