文档介绍：DNA提取方法简介
DNA提取的几种方法
基因组DNA的提取
CTAB法
SDS法
其它
DNA提取的几种方法
非基因组DNA的提取
质粒DNA的提取
碱裂解法
煮沸法
线粒体、叶绿体DNA的提取
差速离心结合SDS裂解法
基因组DNA- CTAB法
CTAB法原理(植物DNA提取经典方法)
CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵),是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,并与核酸形成复合物。
具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性,在这种条件下,蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里
该复合物在高盐溶液中(> NaCl)是可溶的,通过有机溶剂抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
注:CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出,因此在将其加入冰冷的
植物材料之前必须预热,且离心时温度不要低于15℃。
CTAB提取缓冲液的经典配方
组份
Tris-HCl ()
EDTA ()
NaCl
CTAB
β-巯基乙醇
终浓度
100 mM
20 mM
2%(W/V)
%(V/V)使用前加入
Tris-HCl ()提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏;
EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性;
NaCl 提供一个高盐环境,使DNP(脱氧核糖核蛋白)。CTAB溶解细胞膜,并结合核酸,使核酸便于分离;
β-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除
基因组DNA- CTAB法
CTAB提取缓冲液的改进配方
组份
Tris-HCl ()
EDTA ()
NaCl
CTAB
PVP40
β-巯基乙醇
终浓度
100 mM
20 mM
3%(W/V)
5%(W/V)
2%(V/V)使用前加入
PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合物质,有效去除多酚,减少DNA中酚的污染;同时它也能和多糖结合,有效去除多糖。
基因组DNA- CTAB法
PVP(聚乙烯吡咯烷酮)
PVP 按其平均分子量大小分为四级,习惯上常以K值表示,不同的K值分别代表相应的PVP平均分子量范围。K值实际上是与PVP水溶液的相对粘度有关的特征值,而粘度又是与高聚物分子量有关的物理量,因此可以用K值来表征PVP的平均分子量。通常K值越大,其粘度越大,粘接性越强。
在研磨过程中加入PVP,其中的CO-N=基有很强的结合多酚的能力,从源头上减少了酚类被氧化的机会。
同时向抽提液中加入还原剂β-巯基乙醇,后者能打断多酚氧化酶中的二硫键,使多酚不易被氧化,随后经抽提而去除。
CTAB法流程图
植物材料
裂解液
上层溶液
液氮研磨
抽提
细胞裂解
干燥溶解
离心洗涤
酒精沉淀
DNA溶液
基因组DNA- CTAB法
SDS法原理
基因组DNA-SDS法
SDS是一种阴离子去垢剂,在高温(55~65℃)条件下能裂解细胞,使染色体离析,蛋白变性,释放出核酸;
提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度(冰浴),使蛋白质及多糖杂质沉淀,离心后除去沉淀;
上清液中的DNA用酚/氯仿抽提,反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。
组份
Tris-HCl ()
EDTA (pH )
NaCl
SDS
终浓度
10 mM
20 mM
2%
SDS法DNA提取缓冲液
水浴 60min, 其间缓慢摇动几次。
的5mol/ LKac, 混匀, 冰浴15min 左右