实时荧光定量PCR技术.doc

文档介绍：Real-time PCR for mRNA quantitation
一、原理
实时荧光定量PCR技术是通过检测PCR产物中荧光讯号强度来达到定量PCR产物的目的,目前该技术已在动植物基因工程,微生物和医学领域中得到广泛应用。实时定量PCR包括探针法和染料法两种,探针法是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加,特异性高,如Taq ManTM技术;染料法则是利用染料来指示扩增的增加,特异性相对较低,但简便易行。染料法的原理是在PCR 反应体系中,加入过量荧光染料,荧光染料特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。荧光染料发射出的荧光讯号强度与DNA产量成正比,检测PCR 过程中的荧光讯号便可得知靶序列初始浓度,从而达到定量目的。目前染料法实时荧光定量PCR主要使用的是美国Molecular Probes 公司的SYBR Green 1 和SYBR Gold 染料。
二、实验步骤
一)、单链cDNA 摸板的合成(参照相关资料)
二)、Real-time PCR操作方法(TIANGEN 公司RealMasterMix(SYBR Green) PCR Kit)
1、20×SYBR Green solution 在室温下平衡并彻底混匀。
2、将125μL 20×SYBR Green solution ml ×ReaMasterMix 中并轻轻混匀。
3、照表1准备多个PCR反应混合物并分装到各个PCR管中。
4、将PCR管放入热循环仪并启动循环程序(表2)。
三、计算
在定量PCR中,需要经过数个循环后荧光信号才能够被检测到。荧光域值的缺省设置是3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍。在实际操作中一般以前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号。荧光定量PCR中一个关键的数据是“Ct(threshold cycle)值”,其中“t”是Threshold ,即PCR管内荧光超过本底(达到可检测水平)时的临界数值;
“Ct值”的含义是每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。研究表明, 每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多, Ct值越小。
绝对定量的计算
首先利用已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代表Ct值。因此,只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
表1 Real-time PCR 反应体系
组分
体积/反应
体积/反应
终浓度
×ReaMasterMix /2×SYBR solution


1×
上链引物(5μM)


μM
下链引物(5μM )


μM
cDNA(Rt产物稀释5-10倍)


25ng/反应
去离子水
20μL
10μL
总体积
50μL
25μL
表2 Real-time PCR反应程序
循环
步骤