文档介绍：荧光定量PCR技术讲座
------分子生物学实验技术系列讲座Ⅲ
张志坤 2010、09、10
大纲
一、荧光定量PCR技术的基础理论
二、引物及Taqman探针的设计
三、内参基因的选择
四、反应体系的优化
五、实验方案的选择
六、误差分析及操作规范
七、实验中污染的防控
八、实验结果的分析
一、荧光定量PCR技术的基础理论
1、荧光定量PCR技术概论
荧光定量PCR技术产生并成熟于上世纪90年代,由于该技
术实现了PCR从定性到定量的飞跃,能够对PCR反应的全过程进
行实时监控,并且自动化程度高,所以该技术从产生到现在短
短的十几年时间,在科研及检验领域获得了广泛的应用,成为
分子生物学领域不可或缺的一项重要技术。
一、荧光定量PCR技术的基础理论
1、荧光定量PCR技术概论
荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团,利用
荧光信号随着PCR反应的积累来实时监控PCR反应的进程,并通
过分析软件对PCR的反应进行检测分析的技术。
系统组成:定量PCR仪、电脑、分析软件、试剂及耗材。
一、荧光定量PCR技术的基础理论
2、荧光定量PCR常用的三个概念
扩增曲线、阈值、CT值
(1)、扩增曲线及扩增曲线的两种形式
左图反映的是随着PCR反应的进行相应的荧光信号的变化,比较直观,但是指数期很短;右图反映的是荧光信号的变化量的对数与PCR反应循环数的关系,从右图可知,指数期很明显,在确定阈值线时具有简单明了的特点,所以很多软件都采用右图的形式,当然了,这两种实时扩增曲线可以根据实验的需要相互转换。
一、荧光定量PCR技术的基础理论
2、荧光定量PCR常用的三个概念
(2)、阈值线
在荧光定量PCR扩增的指数期,画一条线,在此直线上,
所有样品的荧光强度与其本底荧光强度的差值全部相同。
一、荧光定量PCR技术的基础理论
2、荧光定量PCR常用的三个概念
(3)、CT值
PCR过程中,各样品扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时,所经过的
扩增循环数。
一、荧光定量PCR技术的基础理论
3、荧光定量PCR的化学基础
荧光定量PCR是随着PCR循环的进行,以荧光信号强度的积
累来实时反映PCR反应进程的。理想的荧光物质需具备以下特
点:
(1)、本底低
(2)、荧光强度高
(3)、每轮PCR反应完成后都有荧光强度的增高,而且这种荧
光强度的增高和每轮循环后PCR产物的量成线性关系
(4)、没有PCR产物时,没有荧光
(5)、该荧光物质的受激发后其发射光的波长范围窄,各种
荧光不会产生荧光的交叉干扰
一、荧光定量PCR技术的基础理论
3、荧光定量PCR的化学基础
目前常用的几种荧光物质
(1)、Taqman探针类
5’端标记荧光基团,3’端标记淬灭基团,探针完整时,没有荧光,探针断裂后,在激发光的作用下,荧光基团产生荧光;
探针本身序列与目的基因序列互补,特异性高,退火后探针与目的基因互补序列结合,随着PCR反应的进行,在Taq酶5’---3’外切酶的作用下,探针水解断裂,荧光产生。
一、荧光定量PCR技术的基础理论
3、荧光定量PCR的化学基础
Taqman常用的荧光基团和淬灭基团
荧光基团:5’端常用荧光基团FAM标记,最佳激发光波长:494-495nm,最大
发射光波长:518-520nm。
淬灭基团:TAMRA、BHQ、ECLIPSE等。
TAMRA本身也是一种荧光基团,激发光波长范围较宽,500—
560nm,最佳激发光波长在560nm附近,对FAM基团产生的发射光
具有较好的吸收作用;其发射光波长较宽,560—650nm,当做
多重荧光时,容易产生荧光交叉干扰,并且本底较高,故现已
不常用。
BHQ和ECLIPSE为非荧光物质,只是一种荧光淬灭剂,本身不会
产生荧光,光吸收范围较宽,因此本底较低,作为淬灭基团较
为常用,尤其在多重荧光定量PCR时常常被采用。