文档介绍：第三章植物细胞的悬浮培养
杨柏云
南昌大学生命科学学院
1. 什么是植物细胞悬浮培养:
植物细胞悬浮培养(Cell suspension culture)就是植物细胞或小的细胞聚集体在液体培养基中于摇床上进行悬浮培养。
2. 一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个基本条件:
一是悬浮培养物分散性良好,细胞团较小,一般由几十个以下的细胞组成;
二是均一性好,细胞形状和细胞团大小大致相同以及生理状态同步;
三是生长迅速,悬浮细胞的量一般2~3天,甚至更短时间便可增加一倍。
一. 概述
3. 植物悬浮细胞培养体系的作用:
(1) 为人们在细胞水平上的遗传操作提供了理想的条件。
(2)可在短时间内在细胞水平筛选出预期的突变体。
(3)可直接用来进行原生质体的分离、培养与杂交、基因转移和次生代谢产物的生产等。
因此,植物悬浮细胞培养已成为植物生物技术中一个最有用的手段之一。
二. 操作程序
(一)选择合适的外植体
外植体的选择对以后愈伤组织的诱导很重要,选择合适的外植体进而诱导出疏松易碎的愈伤组织对以后建立悬浮细胞系可以起到事半功倍效果。
1.  双子叶植物中常用的外植体有:幼胚、成熟胚、下胚轴、子叶、叶片、根等。
2.  单子叶植物中常用的外植体有:幼胚、成熟胚、幼穗、花药等。
无论是双子叶植物还是单子叶植物、均以幼胚诱导愈伤组织的为最佳。因为幼胚诱导的愈伤组织质量最好,分化能力强。
在某些情况下直接用幼胚、下胚轴、子叶等作外植体进行悬浮培养,建立悬浮细胞系也可获得成功。
二. 操作程序
(二)诱导疏松易碎的愈伤组织
愈伤组织的外观形态和生理状态直接影响到以后建立悬浮系的质量。因此,应仔细观察、挑选那些颗粒细小、疏松易碎、外观湿润、鲜艳的白色或淡黄色愈伤组织,经过几次筛选,继代至稳定,后用于诱导悬浮细胞系。
而诱导这类愈伤组织的关键是:外植体本身,附加的激素种类和浓度,基本培养基和附加产物等。
外植体:幼胚、幼穗、花药对单子叶植物来说好,而子叶、下胚轴就难诱导
附加激素种类及浓度:一般使用2mg/l 2,4-D, BA。
基本培养基:常用N6、MS、B5等。
二. 操作程序
附加产物:水解酪蛋白、水解乳蛋白、L-脯氨酸、谷氨酰胺、它们均可改变培养基中硝态氮及铵态氮的比例。而二者之间比例可影响愈伤组织的状态和质量。
渗透压:是影响疏松易碎愈伤组织的另一个重要因素,培养基中蔗糖浓度低时(10~30g/l)可能有利于疏松易碎愈伤组织或胚状体的形成。而浓度高时可能有利于坚硬的愈伤组织的形成。
继代的间隔时间:也是影响疏松易碎愈伤组织形成的又一个重要因素,一般疏松易碎愈伤组织不能直接由外植体诱导获得,而是在愈伤组织继代培养过程中通过筛选获得。
二. 操作程序
(三)选择合适的培养基
N6、MS、B5适合单子叶植物
MS、B5、LS、SL等适合双子叶植物。
此外,悬浮培养与愈伤组织培养相比,所需要的营养物质更多,因此,在培养基中加水解酪蛋白、椰乳、脯氨酸、谷氨酰胺等是十分必要的。
还有,培养物生长迅速,pH下降快,故在培养基中要加入pH缓冲剂,如MES(2-吗啡乙基磺酸)等。
二. 操作程序
(四)培养液的灭菌
一般采用高温、高压灭菌(121℃、20min)。但过滤灭菌的培养基更有利于悬浮细胞的培养。因为高压灭菌时会造成:
(1)  部分成分被破坏
(2)  pH发生变化,一般会下降
(3)  出现无机盐的沉淀
另外,水解络蛋白、谷氨酰胺、椰乳等都要采用过滤灭菌方法灭菌。
二. 操作程序
(五)悬浮培养
2克鲜重疏松易碎的愈伤组织放入盛有20~40ml液体培养基的三角瓶中,在摇床上120转/分,25±1℃,黑暗或弱光下培养,2~3d更换新鲜培养基,注意细胞与培养基之间的比例。原有培养基与新鲜培养基比例为1:3。
二. 操作程序
(六)悬浮细胞的继代培养与选择
要得到均一的悬浮系,常用的方法有三种:
一是每次更换培养基时将培养物摇匀,稍静片刻,将上层培养基连同其中的小细胞团倒入另一无菌三角瓶中,弃去底部愈伤组织块或大细胞团,再待小细胞沉入瓶底,弃去大部分培养基,加入新鲜培养基。
二是将培养物摇匀,静置片刻,用吸管取培养基中部的培养物,加入另一无菌三角瓶中,后加入新鲜培养基。
三是过滤,将培养物通过一定孔径的尼龙网或不锈钢网(520um左右)过滤,尔后收集小细胞团进行继代培养。
上述三种方法可结合使用,继代一段时间后便可进行一次筛选,直至建立起分散性良好、均一、生长迅速的悬浮细胞系为止。