文档介绍：山东农业大学硕士学位论文
中文摘要
植物 RNA 依赖的 RNA 聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RDR)最早在中
国卷心菜中发现,后从多种植物中分离出来。研究发现,RDR 以细胞或病毒 RNA 为模
板合成短的 cRNA,参与序列特异的 dsRNA 诱导的基因沉默及抗病毒途径。在拟南芥
中 RDR 有 6 个同源基因:RDR1、RDR2、RDR3a、RDR3b、RDR3c、RDR6。本文以重
要的经济作物棉花(Gossypium hirsutum L. cv. Lumian 22)为实验材料,首次从棉花中
克隆得到 RDR6 基因,并进行了序列比对、表达特异性分析、超表达转基因抗病毒分析
及生长发育等相关鉴定,为进一步明确 RDR6 的功能及作用机理奠定了理论基础。主要
的研究结果如下:
(1)利用 RT-PCR 和 RACE-PCR 的方法,从棉花中克隆得到一个 RDR 基因,并
命名为 GhRDR6(GenBanK 注册号:GQ254649)。该基因全长 4183bp,包括 3591bp
的开放阅读框(ORF),331bp 的 5′非编码区(5′UTR)和 261bp 的 3′非编码区(3′UTR),
编码一条含有 1196 个氨基酸的多肽,预测分子量为 。同源序列分析发现,
GhRDR6 含有全部的 RDR 家族的功能区,并存在典型的保守基序 DbDGD(b 代表任一
残基),它是二价阳离子结合并产生催化活性的位点。进一步分析发现 GhRDR6 与拟南
芥 AtRDR6,普通烟 NtRDR6 和水稻 OsRDR6 同源性较高,分别达到了 66%,66%和
56%,而与棉花 RDR1 的同源性仅仅 31%。cDNA 序列与基因组(GenBank 注册
号:GQ254651)序列比对发现,该基因中含有两个内含子,其中一个位于 5′UTR 中。
Southern blot 实验证明该基因在棉花基因组中以单拷贝形式存在。
(2)利用半定量 RT-PCR 的方法,研究了 GhRDR6 基因在不同表达部位及多种非
生物胁迫下的 mRNA 水平的表达特异性。结果表明,GhRDR6 基因在根系中的表达量
要明显高于在茎、叶中的表达,推测可能参与根系的生长。在水杨酸(SA)、过氧化氢
(H2O2)和 6-苄氨基嘌呤(6-BA)诱导下,该基因表达量没有明显变化,但是在赤霉
素(GA)、茉莉酸(JA)、乙烯(5mM 乙烯利,ET)、萘乙酸(NAA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、
脱落酸(ABA)、盐、冷和伤等处理下 mRNA 水平表达量较高。推测该基因可能参与多
种激素诱导途径。
(3)将 GhRDR6 cDNA 序列连入表达 pBI121,构建正义表达载体,采用农杆菌介
导的方法,转化本生烟(Nicotiana benthamiana),同时转化空载体为对照。经卡那霉素
筛选获得若干植株。经 PCR 和 Northern blot 分析,证明该基因在转基因烟草中成功表
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棉花 RNA 依赖的 RNA 聚合酶 6 基因分离及功能分析
达。选取两个鉴定好的 T0 代转基因植株进行自交繁育,得到 T1 代,对 T1 代进行遗传分
析,发现两个株系均符合 3:1 的分离规律。继续进行自交繁育,得到 T2 代转基因植株,
进行 Northern bolt 实验,证明棉花 RDR6 基因成功表达。
(4)转基因植株根的相对生长情况发现,转基因植株在 3 周时比野生型植株根相
对增长 1-2cm,但是 6 周时这种区别不明显了。在经过 ABA 处理后转基因植株根相对
增长 2-;在 JA、MeJA 和 GA 处理后转基因植株的根较野生型分别增长 1-
和 -2cm,而在经过 6-BA、NAA、NaCl、甘露醇(Mannitol)和 PEG 处理后,转基
因植株根没有明显变化。对转基因种子的萌发率实验中,发现它与野生型植株并没有明
显的区别。
(5)抗病毒实验中,接种 PVY 病毒后,转基因植株对 PVY 病毒表现出明显的抗
性。DAB 染色分析发现,转基因植株中 H2O2 的积累量明显低于野生型。半定量 RT-PCR
分析两种植株中病毒 CP 基因表达量发现,转基因植株中 CP 基因表达量明显低于野生
型,而且转基因植株中 NPR1 基因的表达量高于野生型。在转基因抗病中还发现 Osmotin
基因在转基因植株中表达量增加,而 PR4 基因表达量下降,但是 NbACOI 和 NbPR1a
基因表达量没有明显变化。
(6)转基因植株的抗逆境胁迫研究发现,超表达 Gh