文档介绍：上海第二医科大学
硕士学位论文
双腺病毒介导的Trail基因治疗肿瘤的体外实验研究
姓名:张萍
申请学位级别:硕士
专业:生物化学与分子生物学
指导教师:钱关祥
20040501
双腺病毒介导的蛑瘟浦琢龅奶逋馐笛檠芯利用方法从胎儿脾脏组织中扩增出人虻娜ǔ菇变化,最终都表现为细胞增殖速度与死亡速度的失衡。绍胞揭亡是缀胞的基本生肿瘤【浚虼嗽诙裥灾琢鲋瘟品桨钢校盏贾琢鱿赴⑸蛲鍪且淮蠓较颍妁放疗和彳七疗作用机割均涉及至琢鱿赴暗蛲觯坏蛲龇肿哟シ⒅琢鱿赴蛲鲆亡,但峒せ頝猺而产生严重的炎症反应,会引起致命的肝损伤】,这些毒付作用极大限制了它们在肿瘤治疗上的应用。近年新发现的本实验中,以肿幼魑V瘟品肿樱愿腥拘式细叩南俨《咀魑T靥澹亡麴体步卜实验研究。虽然肿幽芄谎≡裥运盏级裥宰;罩琢鱿赴⑸亡,但是腺病毒的包装细胞,赴彩恰志;挠郎细胞,也有可能“/融合转录因子、启动子”系统对虻谋泶锝第一部分虻目寺⒈泶镌靥宓墓菇ḿ岸灾琢鱿赴逋馍鄙诵вρ芯表达载体一扔τ弥侍褰榈嫉姆椒ㄗH綡术、等脾瘤鲴腹,同对以转染扁种纫胞作为阴性对照。通过法检第二部分/融合转录因子活性的研究中文摘要恶性肿瘤的发生。发展涉及到多种基因的异常。但无论其发病分子基础如何物学行为,是机体维持内稳状态的基础。正常机体可以通过凋亡机制来清除基因改变的异常细胞,一旦这些细胞不能通过凋亡被清除,便可无限增殖,形成恶性是一大热点。肿瘤坏死因子超家族中的猶和虽然都能诱导肿瘤细胞凋肿瘤细胞及转化的细胞发生碉亡而对正常缅施基本无影响这一待征,预示者对、和等肿瘤细胞和O赴髁擞盏嫉在包装过程中被肿佑盏挤⑸蛲觥N1苊獍暗闹卸希颐峭庇τ昧行调控,使其在包装阶段低表达,在感染杀伤阶段高表达。≡裥缘赜盏基因在肿瘤治疗中有广阔的前景。分内容:,籹丘罐摹:仆列⒍偈考窘≮迸
验汪嘣趃靮洼对照,丽疆—蕈独转絷固持缓怼俸为阳蛙对照。,苍谥琢鱿赴谏瘫泶镉址浅S欣第三部分双腺病毒系统的构建及对肿瘤细胞和正常细胞体外杀伤效应研究构建了—甌—虯猚瓽街窒俨方法验证肿幼魑!值蛲龇肿涌梢匝≡裥杂盏贾琢鱿赴鸋、关键词:肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体,/融合转渌因子,腺病毒载体,凋亡构建含有融合转录囡于/的表选载体浚瓽秃惺应用脂质体介导的方法将这两种表达载体共转染、和等肿瘤细胞和赴本譸籊—,单独转染上述细胞作为阴检测报告基因的表达,初步观察到了甌舳拥幕∽B蓟钚很低,这样在腺病毒包装阶段,可以控制蛟细胞内低水平表达;当毒载体,以相同的感染复数共同感染、和等肿瘤细胞和皔暑6谐谩T斯齊琖融合转录因子调控下,在各种细胞系中有高表达后,再通过形态学和生物化学等启动子驱动的报告基因的表达载体一—,加入,融合转录因子后,可以擞活猅舳踊钚裕和发生凋亡,而对正常细胞疚抻跋臁丘罐第:唾科上学顿士学健诒盘
,,疉甌皌”“/篊瓺,.—瓵甆甌瑆、、瓸,瓹,猅’’甇,甌、、·—,.猶.‘‘痑量墙第部ρФ钍垦口蓖
.、、珹¨瑆.:篏//,甇.,——,.瑆.—灰籊一猅狤簍一猅一甌甶——猅猼—瓵.‘‘眎“眀簍,/,.,“丘罐第:唾科上学顿士学健诒盘畍
第一部分虻目寺⒈泶镌靥宓墓菇ḿ岸灾琢鱿赴逋馍鄙诵вρ芯引言利用凋亡基因诱导肿瘤细胞发生凋亡,是众多肿瘤基因治疗方案中的一种。尽管已经有许多研究集中于肿瘤坏死因子家族成员猚【和,但它们在发挥治疗作用的同时还会出现严重的炎症反应和致命肝损伤,这些毒付作用极大限制了甤【和的应用。人们新近发现了一些新的凋亡基因,其中包括因,它作为肿瘤坏死因子家族的新成员,在序列上与其他成员有高度同源,有一些生物学特征也与其他成员相似;但它有自己的特点,即能够选择性地诱导肿瘤细胞发生凋亡,而不伤及正常细胞,这正是吸引大家的地方。为此,我们也选择了蜃魑D康幕颍紫壤弥侍褰榈嫉姆绞阶H綡术、等肿瘤细胞,初步观察它的诱导凋亡的能力。:限制性内切酶、;酆厦籘连接酶籇籐C:为时代呵碇;酵母提取物、胰蛋白胨籇凝胶回收试剂盒、质粒×砍樘岽炕约梁;狹逆转录酶、酶抑制剂、克隆试剂盒篋嘌盒∨QG:无血清培养基:侍澹黄溆嗍约辆=诨蚬治龃俊质粒:。菌株:臼掖ù4。细胞株;、、。主要仪器:低温台式离心机贤夥止夤舛燃仪;超净台;跤;倒置显微镜幻畃丘罐第:粕涎Ф偈垦Ы≮迸
:⒇衅訥:贤哐蠫按公司的说明书进行逆转录,将上述驛定量后,稀释成/、连接、感受态制备、转化和质粒抽提:∪似⒃嘣尤制成匀浆,室温放置种樱患尤确拢缌艺鸬耄椅路胖分钟,,胄种樱蝗∩锨澹尤异丙醇,混匀,室温放置分钟;,