文档介绍：上海第二医科大学
硕士学位论文
Nogo-66的表达、纯化、多抗制备以及生物学活性初探
姓名:谢云峥
申请学位级别:硕士
专业:免疫学
指导教师:陆佩华
20040501
多抗制备以及生物学活性初探泶铩⒋炕中文摘要目的:—肿邮墙昀捶⑾值拇嬖谟谥惺嗌窬字剩芤种粕窬嵬再生的跨膜蛋白,其两个跨膜区之间存在一个氨基酸的结构域,.。趣。本实验旨在通过克隆一分子基因,构建原核表达载体,诱导表达并方法:采用泶镌靥澹ü齈方法从——一至大肠杆菌,筛选、鉴定并经测序验证;诱导表达佐剂充分乳化后免疫新西兰兔,获得兔抗血清,经饱和硫酸铵纯化,获得初步方法检测大鼠脑、脊髓匀浆中的表达;用一融合蛋白作用于细胞,然后用多克隆抗体阻断一分子后观察细胞体结果:获得大鼠一基因工程菌克隆,该克隆可表达目前已有研究证实,一对神经细胞突起再生有明显的抑制作用,近年来对一分子在中枢神经损伤后修复与再生中的研究已越来越引起人们的兴纯化得到一融合蛋白;将融合蛋白免疫家兔,获得相应多克隆抗体,然后对融合蛋白和多克隆抗体进行初步生物学检测。为进一步探索一在中枢神经损伤中的作用及其可能的干预措施打下良好的基础。质粒中扩增出玁颍菇ǔ蓀一一狽柿#;狦—一融合蛋白,利用表达的工程蛋白上具有鲎榘彼的特性,采用变性、以及变性后复性的方法,,并经验证;,并用该多克隆抗体,通过外生长情况。狦—一融合蛋白;获得纯化的狦—一融合蛋白,上海第二医科大学境硕士学位论文中支墒要
该蛋白具有一定的免疫原性:用一融合蛋白免疫新西兰兔,获得初步纯化的兔抗大鼠一特异性多克隆抗体,效价达,该抗体能够检测大鼠脑、脊髓匀浆中蛋白,体外细胞实验表明一融合蛋白能抑制细胞突起生长;而所制备的多克隆抗体能够阻断一分子对白分子对细胞突起生长的抑制作用,表明本研究制各的一融合蛋白和相应抗体都具有良好的生物学活性。一融合蛋白的成功表达利抗关键词:一,基因克隆和表达,多克隆抗体,细胞细胞突起生长的抑制作用。结论:经基因工程诱导表达的一融合蛋白具有免疫原性,将其作为抗原免疫家兔后制备的兔抗大鼠嗫寺】固澹芄挥氪笫竽浴⒓顾柙浆中的蛋白结合;同时研究结果表明该克隆表达的一融合蛋白对细胞突起生长有抑制作用,而制备的多克隆抗体能够阻断一融合蛋一多抗的制备为中枢神经损伤后再生与修复的进一步研究奠定了坚实的实验基础。上海第二医科大学氟硕士晕隹论文中文摘要
“∞∞∞·’。:。,】“。盿騛:.,。“,,.。。!,甤,瑆·.,—畉狿、·...
兰二坚苎苎圭ā览俭皿美家灰苎兰苎墨産瓽,一,..畐:琓瑆篘珿,
忡‘。,前言’:弧癳猰”·觥鲫佟龃!觥!!鯻觥经损伤后再生的基因,命名为基因,薄K嗦氲牡鞍字省!狽鞍祝瓸—、—,·众所周知,成年哺乳动物的中枢神经系统胪庵苌窬低损伤后具有不同的再生潜能。在外周神经,受损的轴突愈合后能够形成生长锥,中枢神经生长锥无法长出新的轴突⋯。那为什么损伤后的中枢神经不能如同外周神经那样自发地进行自我修复呢缙诠鄄焯崾荆惺嗌窬赴嵬磺卸铣跗谟性偕O螅婧竺挥腥魏畏展。近年来,科学家观察到一些成熟的中枢神经细胞轴突能够长入外周神经内,一个新的设想的提出:中枢神经内存在着抑制神经细胞轴突再生的因子。同期一些研究也表明,具有再生抑制功能的分子存在于偻唤褐氏赴纬傻乃杩酸。—屑—L匾煨园被嵝蛄校琋狟没有特异性氨基酸序序列,且都有两个长度分别为和个氨基酸的疏水跨膜区糚。踟生长锥随后可长出新的轴突;然而在中枢神经,尽管损伤后也能形成生长锥,但而当再生的轴突接触到自身的中枢神经组织时,再生便停止了【”。这一现象促使及胶质疤痕内。年,瑞士、美国和英国的三个科研小组同时发现了一种能抑制中枢神网状蛋白易宄稍保且恢种惺嗌窬偕囊种频鞍住S捎诓煌钠舳和的不同拼接,基因有三个不同的转录体,编码三个不同的蛋白,分别称为、—狢,长度分别为、ⅰ霭被列,—被瞬L匾煨园被嵝蛄小狝和~诎被擞相同的蛄校豢拷然耍琋狝、—狢都有相同的卵·觥瘛瘛!觥觥!觥瘛!!鲆籌分子构象示意图图分子结构示意图上谆第二正科土学硕士学懂论文’咄轆前吉
美国科学家通过表位作图构域,这个结构域位于内质网腔或细胞膜外糚。令人感到兴奋表达质粒,诱导表达具有生物活性的~融合蛋白,以及将得到的基因工后再生与修复的进一步研究奠定实验基础。研究表明篘肿拥陌基端和羧基端都位于细胞浆,羧基端两个跨膜区之间存在一个个氨基酸的结的是,该小组在随后的实验中发现,一结构域可抑制中枢神经细胞突起生长并能涛导细胞生长锥坍塌。因此,对一作用机制的进一步阐明将有助于我们更深刻地理解中枢神经损伤后的再生与修复。本课题运用基因工程技术,构建大鼠一原核程抗原免疫家兔