文档介绍：上海第二医科大学
硕士学位论文
OPG基因剔除小鼠杂合子模型的建立
姓名:乔建瓯
申请学位级别:硕士
专业:内科学(内分泌代谢病)
指导教师:宁光
20040401
蛱蕹∈笤雍献幽P偷慕摘要基因剔除又称基因打靶,是通过外源肴旧錎之间的同源重组,精细的定点修饰和改造基因蔚姆椒āJ窃谏锘钐迥谙低逞芯炕功能、转录表达调控、胚胎发育、人类疾病发病机制及筛选新药或新疗法最重要的技术手段之一。本研究建立了剔除虻男∈笈咛ジ上赴⒌玫搅饲合体和杂合子小鼠模型。骨质疏松症是一种以低骨量和骨组织微结构破坏为特征,导致骨骼脆性增加和易发生骨折的全身性疾病。正常成人期骨代谢的主要形式是骨重建。成熟骨组织主要靠骨重建进行着持续的,循环性的破骨与成骨过程,这一过程的有序性偶联调节是维持正常骨量和骨的生理功能的基础。其中骨保护素破骨细胞分化因子,碦逑凳近十年来骨细胞生物学研究中最重要发现之一。荢等于年发现的,具有霭被岬姆置谛偷募钚蕴堑鞍住T谄乒窍赴只奈⒒肪持沙晒牵氏赴置冢魑S斩芴隢狵芴寤化因子—,⑸赫越岷希种芌其配体南嗷プ饔茫佣骺仄乒窍赴姆只鲋常蛲霾⑶矣跋其生理功能】。为了进一步研究虻淖饔茫颐蔷龆ń基因剔除小鼠。小鼠缀个外显子,其中磐庀宰影ū嗦胄藕烹牡拇蟛糠中蛄泻编码一结构域的序列,后者被认为是肱涮褰岷系牟课弧’;如磐显子被剔除,则虻墓δ芡耆А>荽吮狙芯恳栽靥錢为骨架构建了针对小鼠号外显子约耙恍〔糠号内含子拇虬性靥濉通过筛选噬菌体文库,我们得到一段长的∈蠡蜃樾蛄校虻牡,庀宰印S肞方法从的基因组序列上分别扩增了长上海第二医科大学颂士学位论文【
和的片段作为两条同源臂,将两条用于同源重组的片段插入载体,构建了甔基因剔除打靶载体。打靶载体线性化和纯化后通过电穿孔转导细胞,经和≡裥愿患筇羧∷┛剐钥寺觯璓和杂交对双药抗性克隆进行鉴定获得阳性克隆一个。将同源重组的细胞通过显微注射方法导入小鼠囊胚,然后植入假孕小鼠子宫,最后得到了只嵌合比例在%以上的嵌合体雄性小鼠。将嵌合体小鼠与小鼠杂交,对产生的后代中毛色为灰色的小鼠进行基因型分析。结果发现在只嵌合体小鼠中,有荒芄徊鳲基因突变的后代即蛱蕹雍献有∈蟆W哟谢疑∈罄丛从谏诚登逗系腅胞,经蚉鉴定为蛱蕹雍献有∈蟆总之,本研究成功获得了一/杂合子小鼠,为进一步通过育种获得蛱蕹亢闲∈螅诨钐逅窖芯縪基因的功能打下基础,同时也使建立用于研发抗骨质疏松药物的基因剔除动物模型成为可能。关键词:基因剔除护骨素骨质疏松上海第二医科大学颁士学位论文
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引言举世瞩目的人类基因组测序计划已于去年宣告完成,人类己经步入了全面揭示人类生老病死奥秘的后基因组时代。根据人类基因组计划发表的研究报告,人类基因组中约含有,个基因。但迄今为止,有名称纪录或已知功能信息的基因仅占全部基因的约%。在基因功能的研究和开发方面,新一轮的国际竞争已全面展开,对功能基因的争夺已成群雄逐鹿之势。在生物体中,细胞间的相互作用以及神经、内分泌、免疫调控网络对基因的正常生物学功能具有十分重要的作用。因此在生物整体水平研究基因功能已经成为功能基因组学研究的一个重要技术手段。由于小鼠在胚胎发育、组织器官结构和功能、细胞内信息传导或生化代谢通路以及基因组规模和结构等方面与人类极为相似,目前,人们普遍认为经过基因工程修饰的小鼠动物模型,是基因功能、人类疾病发病机制及新药研究开发的最重要的模式生物之一。利用小鼠动物模型研究未知基因的功能,就是将某一基因在小鼠基因组中剔除、突变或将外源基因引入小鼠基因组,产生在遗传上经基因工程改造的小鼠。通过对动物表型变化的分析,在整体动物、细胞或分子水平认识基因的功能。继而可为作用于相关基因靶点的药物研究提供新型药物筛选模型。护骨素,是近年来发现的具有抑制破骨细胞分化及吸收活性的种分泌型糖蛋白,属于肿瘤坏死因子受体超家族。研究表明,在骨质疏松症,风湿性关节炎,∫约岸裥怨亲橹膊骨肉瘤,巨细保瘤,转移性癌鹊姆⒉』疲し篮椭瘟浦芯哂兄匾W饔谩1狙芯炕竦昧薕唬雍献有∈螅=徊酵ü只竦胦基因剔除纯合小鼠,在活体水平研究虻墓δ艽蛳禄。币彩菇⒂糜谘蟹⒖构侵适杷梢┪锏幕因剔除动物模型成为可能。上海第二医科大学硕士学位论文
.┦炕菰琍产物克隆载体—狿公司产品。.体外传至第代的小鼠赴来自∈由上海第二医科大学基础医学院医学遗传教研室保存。禖/、疭纯系小鼠由上海南方模式牛物研究中心繁育。获得的嵌合体小鼠及基因剔除小鼠育种在上海南方模式生物研究中心级动物房进行。各种限制性内切酶、用浮⑺婊锓―标记试剂盒购自及荆髦諸酶、喙厥约良癛狿试剂盒等购白公司。购自蚑尽5鞍酌窴购自上海生工生物