文档介绍：PCR常见问题、原因分析及其对策
主讲人:欧阳志荃
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PCR技术简介
PCR常见问题、原因分析及其解决方案
提高PCR反应特异性的策略
主讲内容
PCR技术简介
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PCR标准反应体系
DNA模板
引物
反应缓冲液
dNTP
ddH2O
耐热聚合酶
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反应体系对PCR扩增的影响
DNA模板
纯度蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应
完整性模板降解会导致PCR扩增无产物
浓度加量过多导致非特异性扩增增加
特异性长度适当、避免二级结构和二聚体
完整性避免反复冻融
浓度应适当,过高导致非特异性增加,过低则
引物
扩增产物太少
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反应体系对PCR扩增的影响
反应Buffer
pH值,盐离子浓度
稳定剂,增强剂
Mg 2+浓度
过高非特异性严重
过低无扩增产物
dNTP Mixture
浓度适当
避免反复冻融
ddH2O
pH值适当
避免污染
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PCR标准反应体系
DNA模板
引物
反应缓冲液
Mg 2+
dNTP
ddH2O
耐热聚合酶
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如何选择最合适的DNA聚合酶
DNA 聚合酶的特性
PCR 实验的不同需求
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如何选择最合适的DNA聚合酶
-- DNA 聚合酶的特性
纯度
稳定性
酶活性
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如何选择最合适的DNA聚合酶
-- PCR 实验的不同需求
长片段扩增
PCR试剂盒
扩增效率
保真性
特异性
基因组扩增、RT-PCR
基因筛选、测序、基因克隆
复杂模板扩增(GC含量高、二级结构)
构建基因图谱、测序、分子遗传学
复杂模板扩增、大规模基因检测
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特异性
- 热启动 Taq酶
原理
蜡封
抗体抑制
化学修饰
特点
避免非特异性扩增
提高PCR反应的
特异性
用途
基因组扩增
RT-PCR
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