文档介绍：上海第二医科大学
硕士学位论文
人内糠素基因全长的克隆及原核表达的研究
姓名:程天庆
申请学位级别:硕士
专业:外科学(骨科专业)
指导教师:龚耀成

人骨糖素基因全长的克隆及原棱表达的研究中文详细摘妥骨糖素魑4嬖谟诠腔手械囊恢值鞍追肿樱罱改瓯妒关注。热擞甏优5墓欠壑蟹掷胩岽扛玫鞍祝⒍云淅砘灾屎蜕物学活性作了初步研究,发现:骨糖素在其他因子鏣—的协助下,有异位成骨的潜能,其作用机制可能是通过抑制破骨细胞的活性,从而发挥促进成骨作用。后来又陆续获得了该蛋白分子的全部氨基酸序列及编码的基因序列。结构研究表明该蛋白分子是一种糖蛋白,其成熟肽部分含有霭被岵谢推测分子量为S谢钚缘牡鞍追肿雍幸桓龆蚣土礁鯪糖基化位点。成熟肽是由含霭被岵谢那疤咫乃獠疤咫氖粲谛》子量的富含亮氨酸蛋白聚糖家族成员然而有意义的是最近有研究者报道,用表达序列标签方法建立人正常垂体组织基因表达谱时,克隆出了骨糖素的全长,通过半定量发现该基因在垂体中表达,且表达量高,鉴于该蛋白在异位成骨中的作用,提出是否存在一条“垂体一骨”的轴线的设想,如果这条轴线真的存在,无疑将会丰富对骨代谢理论的认知。~臼笛榫褪怯萌说拇固遄橹2牧侠丛矗梅肿由镅У姆椒ǎü掷组织总的吧杓铺囟ㄒ铮ü齊醋B际趸竦美增的目的基因片段。将基因片段亚克隆后,经测序分析表明该基因片段雊中公布的娜ǔ蛄型耆恢拢佣な了以前的报道。这也是首次从人的垂体组织中克隆出以往认为只在骨基质中优势表达的骨糖索全长这就提示其组织表达谱并不唯一,其在垂体中表达分泌的生理作用还有待进一步阐明,如果以往对于骨糖索具有诱骨潜能的认识正确,则无疑为存在“垂体一骨”的轴线的设想提供了佐据。为进一步研究骨糖素的功能,本实验的另一项工作是以克隆出的骨糖素全长为模板,通过际趵┰霰嗦氤墒祀牟糠个氨基酸残基的基因片琒
\/—‘‘段,构建原核表达重组质粒,通过谷胱甘肽蛔R泼基因融合蛋白系统,使之在大肠杆菌中表达,经诱导后,利用亲和层析技术,分离提纯融合蛋白,经缬炯ǎ玫揭惶踉蛋白条带,与预计值相符合。该体系的建立,为获得基因工程化产物骨糖素的生物功能研究及意义奠定了基础。关键词:垂体克隆基因表达/
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的蛋白——骨糖素玫鞍妆恢な翟谄渌蜃拥男如残基,推测分子量为,W罱麳吮ǖ烙肊表达序列标签引言有关骨折愈合的过程人们已做了长时间的研究,对该过程的发生、发展、结局及影响因素有了比较全面的认识,也注意到其中一些蛋白分子发挥的重要作用。人们深入研究的目的是试图通过最终阐明其作用机制找到促进骨折愈合及使骨折达到最佳愈合的途径。但鉴于骨愈合过程中参与因子众多,相互作用关系复杂,一些因子间的确切效应至今还难以弄清。同时,临床上每年有大量的骨折延迟愈合,不愈合,异位骨化的病人得不到合理的解释和有效的治疗。一种分析骨生长和修复的方法是通过异位成骨进行的。谄淇4葱缘难究工作中,分离出了一种牡鞍追肿樱哂幸煳怀晒腔钚裕幻9形态发生蛋白尽薄F浜笱芯空哂美嗨频姆椒即从组织中提纯分离蛋白的方法竦昧诵矶嗌镆蜃印=昀碆等人从牛的骨基质中分离出一种新可通过抑制破骨细胞活性等机制促进骨生成跚虼耍玫鞍鬃畛醣幻,笏嫜芯康纳钊耄雌浣峁固卣鳎恢匦孪低趁名为。经过十多年的研究,已陆续获得骨糖素蛋白的氨基酸组成及序列。结构研究表明该分子是一种糖蛋白,其成熟肽部分含霭被的方法,测定出骨糖素基因在垂体组织中有表达,且表达量高,结合其骨诱导活性,提出可能存在“从垂体一骨”的轴线的设想,使得骨糖素的研究更加受到然而,传统的从“组织一蛋白”的研究方法虽然可靠,重复性好,但由于分离产物的纯度往往不高,易交叉污染,且产量少抗ń镒橹荒芑竦檬敢患十微克的蛋白分子岩越泄惴荷钊氲姆治觯寡芯抗ぷ鹘估选K孀欧子生物学技术在近几十年的快速发展,使得从“基因一蛋白难芯砍晌?赡堋尤其是近十几年来,该技术已广泛渗透到许多研究领域。而且应用基因工程技术,在一系列酶的作用下,于体外建立起合适的表达体系,便能高效率,高纯度的获得表达基因产物,支持科学研究和临床应用。正因为此,这项技术越来越受到人关注。们的欢迎。为
柿#琍—柿材料与方法引物,应用—际酰┰瞿康幕蚱希⑼ü虿庑蛞匀分す翘撬本实验就是应用分子生物学方法,从人的垂体组织中分离瓒ㄌ匾在垂体中表达的可能性,并构建原核表达重组质粒,使之在大肠杆菌中表达,获得骨糖素融合蛋白。∽馔馑劳龅恼D行裕炅辏狧,跣裕劳龊小时内切除上述组织,分装在冷冻管中,立即投入液氮中储存备用。饕J约菌株戏交蛑行幕菰;菌株、宿主菌甤瑞金医院上海血液研究所惠赠大连宝生生物工程有限公司弑U婷