文档介绍：实时荧光定量PCR操作步骤
以下实验步骤仅供参考:
1 样品RNA的抽提
①取冻存已裂解的细胞,室温放置5分钟使其完全溶解。
②,盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后,15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相,中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA,混匀后15到30℃孵育10分钟后,于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
④RNA清洗移去上清液,每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA沉淀。混匀后,4℃下7000rpm离心5分钟。
⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时,先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次,使其完全溶解,获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
2 RNA质量检测
1)紫外吸收法测定
先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后,读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值,测定RNA溶液浓度和纯度。
①浓度测定
A260下读值为1表示40 µg RNA/ml。样品RNA浓度(µg/ml)计算公式为:A260 ×稀释倍数× 40 µg/ml。具体计算如下:
RNA溶于40 µl DEPC水中,取5ul,1:100稀释至495µl的TE中,测得A260 =
RNA 浓度= ×100 ×40 µg/ml = 840 µg/ml 或 µg/µl
取5ul用来测量以后,剩余样品RNA为35 µl,剩余RNA总量为:
35 µl × µg/µl = µg
②纯度检测
RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度,。
2)变性琼脂糖凝胶电泳测定
①制胶
1g琼脂糖溶于72ml水中,冷却至60℃,10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液( M)。
10×MOPS电泳缓冲液
浓度  成分
  MOPS,pH
  乙酸钠
  EDTA
灌制凝胶板,预留加样孔至少可以加入25 µl溶液。胶凝后取下梳子,将凝胶板放入电泳槽内,加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。
②准备RNA样品
取3µgRNA,加3倍体积的甲醛上样染液,加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10
µg/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。
③电泳
上样前凝胶须预电泳5min,随后将样品加入上样孔。5–6V/cm电压下2h,电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2–3cm。
④紫外透射光下观察并拍照
28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓(其大小决定于用于抽提RNA的物种类型),上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带,它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖体RNA)组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质,可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染,将会在28S核糖体RNA带的上面出现,即更高分子量的弥散迁移物质或者带,RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。
3样品cDNA合成
①反应体系
序号  反应物  剂量
1  逆转录buffer  2μl
2  上游引物  
3  下游引物  
4  dNTP  
5  逆转录酶MMLV  
6  DEPC水  5μl
7  RNA模版  2μl
8  总体积  10μl
轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。
②混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70℃干浴3分钟,取出后立即冰水浴至管内外温度一致,,37℃水浴60分钟。
③取出后立即95℃干浴3分钟,得到逆转录终溶液即为cDNA溶液,保存于-80℃待用。
4梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因(β-actin)实时定量PCR
①β-actin阳性模板的标准梯度制备阳性模板的浓度为1011,反应前取3μl按10倍稀释(加水27μl并充分混匀)为1010,依次稀释至109、108、107、106、1