文档介绍：实验二:分光光度计的学****之考马斯亮蓝G-250法(Bradford法)测定蛋白质含量定

一实验目的
学****分光光度计的基本原理和使用方法,并使用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量。
二实验原理
考马斯亮蓝G-250(Coomassie brilliant blue G-250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250 在游离状态下呈红色,最大光吸收在488nm;当它与蛋白质结合后变为青色,蛋白质-色素结合物在595nm 波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比,因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合在2min 左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速;其结合物在室温下1h 内保持稳定。该法是1976年Bradford 建立,试剂配制简单,操作简便快捷,反应非常灵敏,灵敏度比Lowry 法还高4 倍,可测定微克级蛋白质含量,测定蛋白质浓度范围为0~1 000μg/mL,是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
三实验材料
1. 实验材料:未知浓度的牛血清样品
2. 主要仪器:试管、移液枪、分光光度计等。
3. 试剂:蛋白试剂考马斯亮蓝G-250 的配制:称取100mg 考马斯亮蓝G-250,溶于50mL90%乙醇中,加入85%(W/V)的磷酸100mL,最后用蒸馏水定容到1 000mL。此溶液在常温下可放置一个月。
四实验步骤
标准曲线制作:取6 支10mL 干净的试管,按表1 取样。摇匀后放置2min ,用1cm 光经的比色杯在595nm 波长下比色,记录测定的光密度OD595nm,并做标准曲线。
表1 低浓度标准曲线制作
管号
0
1
2
3
4
5
1mg/ml标准蛋白(ml)
0

蒸馏水(ml)

0
考马斯亮蓝G-250(ml)
5
5
5
5
5
5
蛋白浓度(mg /ml)
0

OD595nm
0

上图数据标准曲线如下:
拟合标准方程:y=+

另取2 支10mL 试管,按下表取样。, mL放入试管中,加入5mL 考马斯亮蓝G-250 蛋白试剂,充分混合,放置2min 后用1cm 光径比色杯在595nm 下比色,记录光密度OD595nm,并通过标准曲线