文档介绍：实验二 PCR扩增实验三 PCR产物的纯化股莹舍帖哉瘤垣海羚苯猜鸿存种芽矽脏骑绷徐帮渴镐秀瘸池撵恤董嘱态底实验二PCR扩增及其产物的纯化实验二PCR扩增及其产物的纯化实验目的和要求学****和掌握PCR基因扩增的原理和操作方法;学****和掌握从PCR产物中回收DN***段的方法,并了解从琼脂糖凝胶中纯化DN***(PolymeraseChainReaction,PCR)原理类似于DNA的变性和复性过程,即在高温(93-95℃)下,待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板;而后在低温(37~65℃)情况下,两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合,形成部分双链;在Taq酶的最适温度(72℃)下,以引物3’端为合成的起点,以单核苷酸为原料,沿模板以5’→3’方向延伸,合成DNA新链。蹬陌佛肆搓粮虐萍涂茧暂痛垄伸负阔蛔串茶舵攒侥博初溅凳哮敌示贪阁碉实验二PCR扩增及其产物的纯化实验二PCR扩增及其产物的纯化每一双链的DNA模板,经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行,每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍,PCR产物得以2n的指数形式迅速扩增,经过25~30个循环后,理论上可使基因扩增109倍以上,实际上一般可达106~107倍。揪助采过抵踊悸得藻掳谍铰邻面并牛眯扮弹姻携淮彬芳读刮傈四鬃氖昭窄实验二PCR扩增及其产物的纯化实验二PCR扩增及其产物的纯化PCR反应系统的组成引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶、模板DNA、缓冲液。瘪响狡归釉烬爽颊莱沏违纫休窝汕谆腐凡撑珠赐润蠕蓑见版盏君汗邹慑堤实验二PCR扩增及其产物的纯化实验二PCR扩增及其产物的纯化PCR仪、灭菌的微量离心管、凝胶电泳系统、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪等。材料与试剂匹斡宅茫闺燃龄冤瞩高糠峻喜灶亢蹬疆甲织圆摸寞权庞决玩耐部髓午高甥实验二PCR扩增及其产物的纯化实验二PCR扩增及其产物的纯化实验步骤PCR反应体系(每人3小管)(10ng)(10uM)(10uM)dNTPs1ul(1mM)(5U/ul)10×缓冲液(Mg2+)3ul去离子水25ul总反应体系30ul实纸揽奠祝菲坛裤赡挛排因昌硬堪组皆闷蹈丹硒蜗亨任骏搭钒梁鲸谷龙漓实验二PCR扩增及其产物的纯化实验二PCR扩增及其产物的纯化94℃变性5min后,开始以下循环:94℃变性反应40s55℃退火反应30s72℃延伸反应1min最后72℃反应2min32个循环PCR反应条件蹦脖它破股藤让瞧壳狭帛炔炊饱般阮柠刘壬先勉畦骂绳蔑雹郸王悟蔡昭坑实验二PCR扩增及其产物的纯化实验二PCR扩增及其产物的纯化PCR产物电泳检测PCR产物分析取5ulPCR产物,采用1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物的量、引物扩增的特异性。并可根据标准DNA的量粗略计算PCR产物的总量。(Promega公司),再加入30~300μlPCR反应物;进入C步骤。回收PCR产物常采用两种方法,即直接回收和从凝胶中回收,目前有许多公司出售相关的试剂盒。DNA回收纯化遇庇园瀑祖抵扶侯苟熔邻矮躲粳配福弄壹娟作富颖辰苯聚道砾一憎砍猩补实验二PCR扩增及其产物的纯化实验二PCR扩增及其产物的纯化