文档介绍：第二军医大学
博士学位论文
脱钙骨基质纳米化条件及其复合重组人骨形态发生蛋白作为骨
移植替代物的实验研究
姓名:黄凯
申请学位级别:博士
专业:外科学
指导教师:贾连顺
2011-04
脱钙骨基质纳米化条件研究及其复合重组人骨形态发生蛋白作为骨移植替代物的实验研究
脱钙骨基质纳米化条件及其复合重组人骨形态发生
蛋白作为骨移植替代物的实验研究
中文摘要
在现代高科技和高能量的战争中,伤员骨结构的损伤往往较为严重,骨缺损
发生率高,在后期的功能重建中,植骨术将发挥重要作用,单纯依靠有限的自体
骨在很多情况下难以满足要求,植骨替代物的研制和临床应用将为骨战(创)伤
的修复提供必要的物质准备。
临床上对于各类脊柱伤病患者行手术治疗后造成的脊柱不稳,常需进行脊椎
融合术,因而脊椎融合术是脊柱外科中最常施行的外科手术方式。据统计,在美
国每年约要进行 425,000 例以上植骨融合术,其中 60%以上为脊柱融合术。相
应的用于脊椎融合术的骨移植替代物和促进骨移植相关产品的医疗市场达 4~20
亿美元。按此估算,我国每年实施的脊椎融合术数量应不亚于这一数字,其未来
的骨移植材料市场需求极大。目前国内外用于骨移植的材料绝大多数为自体松质
骨移植。虽然自体松质骨,特别是自体髂骨被认为是骨移植材料的金标准,但其
也存在明显的缺点,如:来源有限,不能满足大段骨缺损和各类翻修手术的需要,
特别对于小儿患者;供区并发症带来的额外痛苦,有报道在 5%~25%,主要有:
血管、神经损伤,骨折,血肿,感染和慢性疼痛等;延长了手术时间,相应地增
加了出血量。因此多年来,各国学者均致力于寻找合适的骨移植替代物以替代自
体松质骨,近 10 年来,骨移植和骨移植替代物的研究始终是脊柱外科领域中的
热点之一。随着提高,临床上应用骨移植替代物取
代自体骨进行植骨术已成必然趋势,研制和开发适合我国国情的植骨替代物已迫
在眉睫。
近年来,纳米技术已成为材料学领域引人注目的研究热点。全球对于纳米材
料、纳米技术在生物医学的应用有了广泛的研究,但是少有应用到骨科领域。本
课题通过纳米脱钙骨基质复合重组人骨形成蛋白的制备及相关实验,寻求一种良
好的骨移植替代物。
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第二军医大学博士学位论文
研究目的
1. 制备人同种异体脱钙骨基质,为脱钙骨基质的纳米化作准备。
2. 确定人同种异体脱钙骨基质的最佳纳米化工艺
3. 探索 Nano-DBM/rhBMP-2 复合物的方法及复合物的塑形方法
4. Nano-DBM/rhBMP-2 复合物的相关检测。
5. 家兔腰后路椎板间融合实验,研究观察植骨融合效果。
材料和方法
1. 将术中切取的人同种异体骨(除外肿瘤、感染及各类传染性疾病),剔
除骨膜和软组织,将异体骨劈成骨条,刮除骨髓。用无菌净化水反复冲
洗,无水乙醇脱水 2 小时,乙醚脱脂 1 小时后通风干燥,置-80℃冰箱备
用。脱钙骨基质的制备采用改良 Urist 法,具体制备流程如下:1、无水
乙醇浸泡 2 小时;2、去乙醇加乙醚浸泡 1 小时;3、蒸馏水反复冲洗 3
次,去尽乙醚;4、盐酸浸泡 72 小时,浸泡过程中不断搅拌,充分
脱钙,每 12 小时更换盐酸溶液;5、蒸馏水冲洗 3~5 次后用蒸馏水浸泡
过夜,充分去除骨块内的盐酸;6、无水乙醇浸泡 2 小时;7、去除乙醇
后乙醚浸泡 1 小时;8、通风处干燥后得到脱钙骨基质。通过急性毒性
试验、热原实验、溶血试验、肌肉种植实验检测 DBM 的生物安全性。
2. 将 DBM 颗粒放入液氮冷冻球磨粉碎机进行研磨,粉碎机转速为 800RPM,
研磨半小时后取标本进行电镜扫描观察颗粒大小。最终取得微米级的
DBM 颗粒。研磨过程中控制液氮注入速度,约 8L/小时,使液面始终稍
高于研磨球,避免温度过高破坏 DBM 及其携带的蛋白因子。随后根据
预实验结果,将液氮冷冻粉碎所得 DBM 粉末按溶质:溶剂比 10%,置
于 MICROS 湿式超细研磨粉碎机内进行粉碎。MICROS 初始研磨温度
为 17℃,工作中最高温度为 25℃,研磨时由循环水进行冷却降温,研
磨转速选择该机器最稳定的速度,研磨过程中取标本进行激光粒度仪分
析,观察颗粒直径变化情况,待颗粒直径不再继续变小时停止研磨。研
磨结束后将匀浆进行高速离心,取得纳米 DBM 标本,按比例将 rhBMP-2
均匀混合于纳米 DBM 中,并将混合物标本置于模具内塑形,置于-56℃
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脱钙骨基质纳米化条件研究及其复合重组人骨形态发生蛋白作为