第一节 pcr扩增获得目的基因或cdna第二节 基因组文库的.ppt

文档介绍：第一节 PCR扩增获得目的基因或cDNA
第二节基因组文库的构建与基因分离
第三节 cDNA文库的构建与筛选
第四节根据差异表达获得目的基因
第五节基因的化学合成
第五章目的基因的获得
基因克隆的本质是把某一目的DN***段通过无性方式进行扩增和表达,而这一过程往往是通过载体和寄主细胞来实现的。
一般而言,基因克隆包括四部分工作:
1、目标DN***段的获得;
2、克隆载体的构建;
3、寄主细胞的转化;
4、重组体克隆的选择和鉴定。
目前,以大肠杆菌为寄主,以质粒和噬菌体等为载体的基因克隆体系已经相当的成熟。
大肠杆菌作为寄主进行DNA克隆的实验方案
DN***段
的获得
载体构建
细菌转化
重组体
的鉴定
限制性内
切酶消化
机械切割
双链cDNA
的合成
化学法
直接合成
同聚物
加尾
粘性末端
连接
平末端
连接
加接头造成
粘性末端
重组噬菌体
DNA转染
重组质粒
的转化
体外包装
进行转导
表型鉴定
核酸杂交
免疫学分析
酶切鉴定
PCR法定向扩增目的基因的基本原理
PCR(Polymerase Chain Reaction)法,又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术,是一种高效快速的体外DNA聚合程序
使用PCR法克隆目的基因的前提条件是:已知待扩增目的基因或DN***段两侧的序列,根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物。
第一节 PCR扩增获得目的基因或cDNA
基于PCR的分离法
(1)直接从基因组中扩增
提取基因组DNA作模板
根据目的基因序列设计引物
PCR扩增

适合扩增原核生物基因。
真核生物基因组含有内含子!
原核基因组部分
原核细胞
提取基因组DNA
PCR扩增
基于PCR的分离法
(2)从mRNA中扩增: RT-PCR
提取基因组 total RNA
反转录合成总cDNA作模板
根据目的基因序列设计引物
PCR扩增
适合扩增真核生物基因。
原核生物不易得到mRNA,也不含有polyA尾。
目的基因
的引物1
反转录成目的基因cDNA第一链
目的基因cDNA第二链
PCR
mRNA
目的基因
的引物2
基于PCR的分离法
(3)同源序列克隆法
依据:
自然界的长期进化中,一些蛋白质的基因编码序列保持着高度的保守性,在生物的种属之间,基因编码序列有着很高的同源性。
方法:
根据同源序列设计引物进行PCR扩增,利用PCR产物进行RACE扩增或结合DNA文库进行分离目的基因。