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嗜肺军团菌基因的克隆及其原核表达【论著】2DepartmentpneumophilatoIPTGThe巨噬细胞内增殖。细菌黏附于宿主细胞表面是侵犯机与宿主细胞表面的特异性受体结合,是细菌感染的第112.,,通过空气以气溶胶形式感染人和动物,并在肺泡上皮细胞和单核体感染致病的先决条件。菌毛是细菌的黏附结构,能R猐pilEpETpile合酶链反应邮确尉啪蜃镈中扩增军团菌Ⅳ型菌毛蛋白基因,并将其定向克隆至原核表达载体,构建原核表达重组质粒猵拗菩阅谇忻讣ā及测序分析后,转化宿主菌大肠杆菌,IPTGSDS-PAGE429bppilE达重组质粒猵泶锍kDapilE菌中得到了高效表达,为以后深入研究奠定了基础。丶蔧军团菌;基因;克隆;基因表达型挤掷嗪臸南妆晔堵隴A[]———,Jianpin92,pETpilEidentificationt}l籶籧;基金项目:教育部博士学科点专项科研基金资助项目(20060610091)1(750004)2作者简介:杨志伟,副教授,基础医学教研。173Zhi-weilCAOImmunologyNingxiaCollege750004NingxiaRegionChina,·
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壹生虫痘皇感鎏丝瘥痘生旦筮唧呃莩嶙塑璺璺堕业芩芡鲤骸好:苎7从崾笕汕扩增产物,用%lgG(H+L)DAB量提取质粒,随后对所提质粒采用引物、进行单、双酶切鉴定。质粒的细菌,菌液送上海英骏生物技术有限公司,用通一步。因此,菌毛和细菌的致病性密切相关。军团菌基因编码的Ⅳ型菌毛蛋白,与军团菌的毒力紧密PCR基因,将其定向克隆人原核克隆载体菇ㄖ刈橹柿—,经鉴定后,并使基因在原核系统中得到高效表达,为进一步研究Ⅳ型菌毛蛋白结构、功能、致病机制及免疫性提供研究基础。1材料嗜肺军团菌标准株及相应兔血清抗体由中国疾病预防控制中心传染病控制所惠赠。克隆宿DH5pET-32a(+)制性内切酶蚗TOYOBONEBT4DNA购自北京中杉金桥生物技术有限公司。,收获细菌,提取其基因组譐。根据文献报pilEJpilE57I引物序列如下:上游弓’一(P2)550LPCREx山,pmoLL)1DNA穕,灭菌蒸馏水扩增设1lDNA945min9430℃退火延伸s30725琼脂糖凝胶电泳检测。.,用庸梗;恤惺芴珼,375含氨苄(60/的培养液,∶盖屑癙鉴定阳性重组pETpilE步鉴定。基因的诱导表达pET32a(+)猵柿W;紹妇校又钟含氨(60/的培养液,培养至对数期(A550=06)10的诱导,收01246h10SDS染色、脱色,拍照保存结果。分析取适量诱导不同时间的蛋SDSPAGE4膜,与簂∈偷耐醚G一抗℃过夜,再次洗膜,与000()371珼显色试剂盒显色,拍照保存结果。221pilEPCRP1对嗜肺军团菌基因组蠵扩增,1O430(1)猵腜及限制性酶切鉴定采用引物、对所构建的重组质粒畃蠵扩增,430预期大小的条带;用限制性内切酶运竦弥刈