文档介绍：总RNA的提取、定量与RT-PCR
南方医科大学
生物化学与分子生物学实验教学中心
完整RNA的提取和纯化,是进行RNA 方面的研究工作如Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。
掌握从细胞中提取总RNA的方法
熟悉紫外吸收法检测RNA浓度与纯度的原理及测定方法
掌握RT-PCR基因扩增的原理和过程
目的
实验流程
提取原理
操作步骤
逆转录原理
操作步骤
提取
总RNA
定量
合成cDNA
第一链
原理体系
引物选择
PCR
电泳原理
电泳步骤
电泳
计算方法
操作步骤
第一部分细胞总RNA的提取及定量
原理
10-5mg RNA/细胞
mRNA 3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA) 结构,可用oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。
RNA分离的方法:异硫氰酸胍氯化铯超速离心法,盐酸胍-有机溶剂法,氯化锂-尿素法,蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。
目前常用的是Trizol法。
rRNA 80-85%:28S 18S 5S
tRNA, snRNA 10-15%
mRNA 1-5%
Trizol的主要成分
Trizol 是一种新型总 RNA 抽提试剂
主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂,是一类强力的蛋白质变性剂,可溶解蛋白质,其主要作用是裂解细胞,使细胞中的蛋白/核酸物质解聚得到释放。
酚虽可有效的变性蛋白质,但是它不能完全抑制RNA酶活性,因此Trizol中还加入了8-羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。
在加入氯仿离心后,溶液分为水相和有机相,RNA在上层水相中。
取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA;用乙醇沉淀中间层可回收DNA;用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。
原理
所有RNA的提取过程中都有五个关键点:
样品细胞或组织的有效破碎;
有效地使核蛋白复合体变性;
对内源RNA酶的有效抑制;
有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离;
对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。
关键点
RNA酶污染来源
RNA酶可耐受多种处理而不被灭活,如煮沸、高压灭菌等。
严格控制外源性RNA酶的污染:外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等,也可存在于灰尘中,造成器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂的污染。
最大限度地抑制内源性的RNA酶:而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。
防止RNA酶污染的措施
所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6h或更长时间。
%DEPC水浸泡12h以上,高压灭菌。
有机玻璃的电泳槽等,可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再浸泡在3%H2O2室温10min,%DEPC水冲洗,晾干。
% DEPC在37℃处理12h以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂,应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制,然后经滤膜过滤除菌。
操作人员戴一次性口罩、帽子、手套,实验过程中手套要勤换。
设置RNA操作专用实验室,所有器械等应为专用。