文档介绍：EV71病毒特异性单克隆抗体的筛选及鉴定
(作者:___________单位: ___________邮编: ___________)
作者:李静, 蔡芳, 高强, 王宾
【摘要】目的: 筛选高亲和力和高中和活性的抗EV71病毒的单克隆抗体(mAb), 并对其特异性和抗原表位进行鉴定。方法: 采用葡萄球菌A蛋白亲和层析法纯化mAb, 并进行抗体的中和效价、交叉反应性以及表位进行分析。结果: 筛选出1株抗EV71病毒的mAb, 纯度大于95%, 抗体滴度达到10-7, 对EV71病毒具有广谱中和特性, 与CA16无交叉反应, 为VP1特异性, 并识别EV71的构象型表位。结论: 筛选出1株具有高亲和力和中和活性的EV71病毒的mAb, 为研制EV71病毒感染性疾病的诊断试剂提供了重要工具, 并为研制治疗性mAb提供了条件。
【关键词】 EV71; 单克隆抗体; 中和活性
肠道病毒71型(EV71)是人肠道病毒的一种, 其感染性强且致病率高, 对中枢神经系统的侵害尤其严重[1]。EV71与A组柯萨奇病毒(Cox Al6型, CA16)是引起手足口病的主要病原体。手足口病是全球性传染病, 近年来手足口病已经成为越来越威胁国内外儿童健康的广泛流行性疾病之一。为指导全国各地做好手足口病的预防控制, 2008年卫生部发布《手足口病预防控制指南》; 规定自2008年5月2日起, 手足口病纳入丙类传染病管理。EV71病毒为小RNA病毒科、肠道病毒属。引起的手足口病预防控制难度大, 目前针对EV71引起疾病的疫苗、特异性治疗药物等防控手段尚在研制中。高质量的EV71单克隆抗体(mAb)有可能用于研制治疗性mAb、 EV71患者血清学诊断以及EV71病毒疫苗的抗原含量的检测, 因此具有重要的应用价值。我们在本实验中筛选了多批EV71 mAb, 并对其生物学特性进行了比对研究。
1 材料和方法
材料抗EV71病毒mAb腹水由北京科兴生物制品有限公司提供, 共12个克隆, -。PEG2000购自Sigma公司。Micro BCATM Protein购自PIERCE公司, HRPGAM IgG购自Jackson ImmuNoresearch。其他试剂由北京科兴生物制品有限公司提供。Gel200凝胶成像仪购自Kodak公司。
方法
mAb的腹水效价测定采用间接ELISA法[2]。 mol/L PBS 1∶100稀释, 包被于酶标板, 4℃过夜; 以含100 mL/L小牛血清、 10 g/L酪蛋白、 100 g/L蔗糖(北京科兴生物制品有限公司提供) mol/L PBS溶液封闭。 mol/L PBS溶液10倍系列稀释后加入酶标板反应, 酶标二抗为HRPGAM IgG, 用TMB显色, 读取A450值。BALB/c小鼠阴性血清作为阴性对照。, 来判定mAb腹水的效价。
mAb腹水的纯化将mAb腹水采用葡萄球菌A蛋白(SPA)亲和层析法纯化[3], 并用PEG2000浓缩纯化后mAb; 采用Micro BCATM Protein Assay Kit检测纯化抗体蛋白浓度; 常规还原型SDSPA