文档介绍：第三军医大学
硕士学位论文
人血管内皮细胞氧化应激损伤中的作用研究
姓名:王凡
申请学位级别:硕士
专业:营养与食品卫生学
指导教师:糜漫天
2011-05
第三军医大学硕士学位论文

PPARγ在大豆异黄酮抑制叔丁基过氧化氢诱导
人血管内皮细胞氧化应激损伤中的作用研究

摘要

心血管疾病(Cardiovascular disease,CVD)是一系列涉及循环系统的疾病,其发
病率占全球总发病率的三分之一以上,更是发达国家最为主要的死亡原因,在发展中国
家的死亡率也逐年递增。心血管疾病的发生常常与动脉硬化有关。
动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是一类严重威胁人类健康和生命的疾病。随着
我提高和饮食习惯改变,该病也成为我国的一个主要死亡原因。AS 的
发病机制复杂,一般认为该病是多种因素长期共同作用的结果,其中氧化应激是 AS 斑
块形成学说中的重要组成部分,活性氧族(reactive oxygen species, ROS)大量生成导致
的内皮细胞(endothelial cells, ECs)功能性损伤是 AS 发生的始动环节。
大豆异黄酮(soy isoflavone,SI)是天然存在于豆科植物中,在豆类生长中形成的一
类次级代谢产物,属于黄酮类化合物的一种,因与雌激素有相似的结构,而被称为植物
雌激素。SI 具有广泛的生物学效应,如抗肿瘤、防治骨质疏松、改善更年期症状、治疗
心血管疾病等多方面效应,体内实验表明其具有抗动脉粥样硬化效应。染料木黄酮
(Genistein, Gen)是 SI 在人体内的主要存在形式,也是研究最多的 SI,大量有关 SI 的
体内外实验都是围绕 Gen 展开的。流行病学证据显示有摄食大豆制品传统的亚洲国家特
别是中国和日本 CVD 发病率远低于欧美国家,进一步研究发现亚洲人血清中的 Gen 可
达 300 nmol/L,远远高于没有食用豆制品(6 nmol/L)。
但是,有关 Gen 抗 AS 的分子机制尚不清楚。过氧化酶体增殖物激活受体(peroxisome
proliferators-activated receptor gamma, PPARγ)是核受体超家族中的一员。近期研究发现
PPARγ活化后可改善内皮功能。由此,我们推测,Gen 是通过活化 PPARγ来保护内皮
细胞并进一步达到抗 AS 的效果。
基于上述分析,结合国内外研究进展,本研究以人血管内皮细胞株为研
究对象,首先建立以叔丁基过氧化氢(tert-butyl hydroperoxide,t-BHP)诱导的氧化应
激损伤体外模型,然后以 Gen 和 t-BHP 对内皮细胞株进行单独和联合处理,
K-8、荧光染色法(fluorescent staining)和流式细胞仪观察 Gen 对内皮细胞的活
性及凋亡的影响,并运用蛋白免疫印迹(Western blot,WB)检测 Caspase-3 的表达变化;
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另外以 Gen 对内皮细胞株进行处理,运用蛋白免疫印迹、免疫细胞化学
(immunohistochemistry,IHC)以及 Real-time PCR 等实验方法,观察 Gen 对
中 PPARγ蛋白表达以及核转位的影响,K-8 法检测抑制剂 GW9662 对 PPARγ
保护内皮细胞凋亡的影响,旨在揭示 PPARγ在大豆异黄酮抑制氧化应激诱导人血管内
皮细胞损伤中的作用。

主要研究结果和结论如下:
1. 利用 t-BHP 建立人脐静脉内皮细胞株的体外氧化应激损伤模型。按梯
度向接种的细胞中加入不同浓度的 t-K-8 法检测发现,t-BHP 能明显抑制
的生长,至最大浓度 240 μmol/L 时,抑制率达到(±)%,半数抑制
浓度(IC50)为 100 μmol/L;激光共聚焦显微镜观察发现在的细胞核区域出
现明显的凋亡小体;
2. 按梯度向接种的细胞中加入不同浓度的 K-8 法测定后发现 Gen 能显著
抑制 t-BHP 诱导的内皮细胞凋亡,并呈明显的剂量-效应关系,500 nmol/L 时,预处理
组的细胞保护率为 %,流式细胞仪检测亦发现此时总凋亡率为 %,与对照组
相比,P<;Western blot 检测结果表明 Gen 能明显抑制 Caspase-3 的表达,且在 50