文档介绍：江南大学
硕士学位论文
抗菌肽快速筛选方法与抗菌活性的研究
姓名:高飞
申请学位级别:硕士
专业:营养与食品卫生学
指导教师:乐国伟;施用晖
2011-07
摘要
摘要
本文利用抗菌肽与微生物作用前期与细菌膜吸附结合过程,研究一种能实现抗菌肽
快速筛选并确定其一级结构的方法。通过对比与大肠杆菌孵育前后 UPLC 图谱的变化,
从中选择出消失的峰组分即为可能的抗菌肽组分,并对孵育前和孵育后的各峰组分抑菌
活性分别进行测定,以验证抗菌肽的筛选结果。选取两种不同来源的原料进行验证。
将家蝇蝇蛆蛋白粗提液和乳酸菌 LP6 固态发酵大豆蛋白提取液分别通过 UPLC,分
别对比与大肠杆菌孵育前后的图谱变化,快速筛选图谱中消失的峰组分,分别命名为
HLP7、HLP8、FSP6、FSP8、FSP9。通过 RP-HPLC 对两种原料孵育前后的各峰组分别
进行收集并测定抗菌活性,实验结果表明,具有较强抗菌活性的只有消失的组分 HLP7、
HLP8、FSP6、FSP8、FSP9,其他未消失掉的组分均无抗菌活性。证明通过此方法能够
实现抗菌肽的快速筛选,可以大大减少抗菌肽发现的实验周期。
对 HLP7、HLP8、FSP6、FSP8、FSP9 对不同致病菌的抗菌活性进行检测,结果表
明这几个组分对大肠杆菌 25922、鼠伤寒沙门氏菌 50013、绿脓杆菌、枯草杆菌
9372 与金黄色葡萄球菌 6538 等致病菌均具有较强的抗菌活性,其中 FSP8 和 FSP9 对工
程菌 JM109 工程菌也有抗菌活性。
分别检测五种抗菌肽的抗菌活性,表明随着抗菌肽疏水性的增强,抗菌活性也增强。
经 MAFSPI-TOF/TOF-MS 质谱鉴定其氨基酸序列分别为:KPPLNGPAL 、
QPVYHWYWH、VVTSSSLP、RMRLLLRRKGGQ 和 RVLLLPAFAEK,经在线三大数
据库搜索均为新发现的抗菌肽,将序列与已知抗菌肽序列进行对比结果发现新发现的抗
菌肽与已知抗菌肽中的保守序列有较大相似性,如对抗菌活性其关键作用的 Pro、Trp,
以及带正电荷 Lys、 His 等碱性氨基酸。而在和大肠杆菌孵育中未消失的组分由于疏水
性较低、不带正电荷等原因使之疏水性和电荷数未处在适合的平衡中,因此均表现为无
抑菌活性。
计算 103 种已知抗菌肽序列的平均疏水性 Q 值,发现 Q 值多分布在-~ 间,
经分离实验所得五种抗菌肽也属于此范围,表明适合的疏水性大小对抗菌肽的抗菌活性
起关键作用,同时抗菌肽的疏水性残基比率多分布在 10%-70%,集中在 40%-50%。抗
菌肽所带净正电荷分布随抗菌肽的长度增加而显著增加(P < ),此外,不同的作
用机制对正电荷数目有不同要求。针对抗菌肽的肽序分析结果表明对于抗菌肽与微生物
膜相互结合过程中起重要作用的疏水性和带电荷性抗菌肽的疏水性和带正电荷性质处
在动态平衡关系中,二者存在显著负相关(P < ),相关系数 r = -,且多数
抗菌肽均具有疏水性较强的特点。实验得到的五种抗菌肽洗脱流动相的乙腈百分比在
40%、43%、39%、%和 50%左右,疏水性残基比率集中在 30%-50%,均具有较强
的疏水性,符合多数抗菌肽的一般特征。
关键词:抗菌肽、快速筛选、抗菌活性、UPLC、疏水性
I
Abstract
Abstract
Depending on the peptide–membrane interaction mechanisms of antimicrobial peptides,
investigate a method which can rapid select antimicrobial peptides. Using Liquid
Chromatography-mass Spectrometry pare with the spectrum before and after extract
incubated with , collect the peaks which are disappeared. The results indicated that
compared with the spectrum before and after extract incubated with bacteria can provided a
rapid and direct method for identification of antimicrobial peptides. Usi