文档介绍：IL10对大鼠原代肝细胞增殖的影响
(作者:___________单位: ___________邮编: ___________)
作者:林羡屏, 黄月红, 郑伟达, 陈运新, 陈治新, 王小众
【摘要】目的: 探讨IL10对体外培养大鼠原代肝细胞增殖的影响。方法: 胶原蛋白酶原位灌流法分离大鼠肝细胞, RTPCR法检测肝内不同细胞标志基因的表达情况, 对比原代肝细胞与大鼠正常肝组织的检测结果, 进行细胞纯度鉴定; RTPCR法检测原代肝细胞IL10和IL10受体α(IL10Rα)的表达情况; 原代肝细胞分3组培养: 正常组(N组)、对照组(C组)和IL10干预组(I组); 通过MTT分析、台盼兰细胞计数以及流式细胞术检测DNA含量等方法, 了解外源性IL10对肝细胞增殖的影响。结果: 细胞鉴定结果显示, 所有的标志基因在肝组织都可检测到有较高的表达, 原代肝细胞虽高表达肝细胞标志基因, 而肝内其他细胞的标志基因则不表达或低表达。RTPCR检测显示原代肝细胞可表达IL10和IL10Rα。台盼兰细胞计数提示IL10干预48 h, %(); MTT检测亦显示IL10干预24、 48 h, %%(); 流式细胞术检测结果表明IL
10干预24 h, %, I组较C组降低(), 甚至低于N组()。结论: 分离的原代肝细胞纯度较高, 大鼠原代肝细胞表达IL10/IL10R mRNA, IL10抑制大鼠原代肝细胞增殖。
【关键词】原代肝细胞; IL10; IL10R; 细胞增殖
白细胞介素10(interleukin10, IL10)是一种抑制性细胞因子, 具有抗炎症作用, IL10受体α(IL10Rα)介导IL10参与各种各样的效应。IL10对治疗许多肝脏疾病如肝纤维化, 有着良好的应用前景, 动物模型实验已证实外源性IL10具有减轻肝脏炎症损伤和肝纤维化的作用[1-3]。IL10与肝纤维化相关研究的对象, 主要是放在HSC、 KC等细胞, 对肝细胞的研究相对较少; 部分学者从组织学、血清学水平研究IL10对肝细胞的作用, 针对性不足, 要阐明作用机制还远远不够。基于以往对大鼠原代HSC和肝纤维化的研究[3], 我们将分离大鼠原代肝细胞, 检测大鼠原代肝细胞IL10/IL10RαmRNA的表达, 流式细胞术检测及MTT实验等方法研究IL10对肝细胞增殖的影响。
1 材料和方法
材料 SD大鼠(4只, 雄性, 重250~300 g), 购自上海实验动物中心; 重组大鼠IL10(深圳晶美生物工程公司), IV型胶原酶(Sigma公司), DMEM培养基干粉购自Gibco公司, 小牛血清购自杭州四季青公司, 细胞周期试剂盒购自北京天来生物医学科技有限公司, MTT购自Fluka公司, 台盼兰购自上海捷倍思基因技术有限公司。RNA抽提试剂盒(美国Gentra公司); AMV逆转录试剂盒由(美国Promega公司); IL
10/IL10Rα引物及相应PCR试剂盒(TaKaRa公司); 其余引物(生工生物工程公司), 相应PCR试剂盒(美国Promega公司); 流式细胞仪(COULTER EPICSXL, Backman公司)。
方法
肝细胞的分离、鉴定、培养和冻存取正常SD大鼠, 采用胶原蛋白酶原位灌流法分离出肝细胞, 具体操作方法见参考文献[4], PAS染色鉴定显示肝细胞纯度, 台盼兰拒染法计数活细胞比例, 按常规细胞冻存方法, 冻存肝细胞于液氮罐中备用[5], 使用前培养于含10 mL/L胎牛血清的DMEM培养液中。
原代肝细胞鉴定分离得到的原代肝细胞以及新鲜肝组织块, 抽提总RNA, RTPCR法检测肝细胞和肝内其他主要细胞的标志基因表达, 相鉴别的细胞和相应的鉴别标志基因如下, 肝细胞白蛋白、甲胎蛋白(AFP)和细胞色素P450基因CYP2B1和CYP2B2; 胆管细胞CD19, 内皮细胞CD31, Kupffer细胞CD68[6, 7], 肝内产胶原细胞如星状细胞前胶原酶I(preCollagenI, PCI)。抽提细胞总RNA、逆转录、 PCR、凝胶电泳成像的方法步骤参考[8]; 此外结合原代肝细胞PAS染色观察糖原颗粒, 辅助鉴别。引物序列: Albumin: F: 5′AAGTACATGTGTGAG3′; R: 5′GGTTCTTCTACAAGAGGCTG3′; 373 bp. CK19: F: 5′