文档介绍：NT4ApoptinHA2TAT融合基因重组腺相关病毒的构建及鉴定
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【摘要】目的: 构建编码融合基因NT4ApoptinHA2TAT的重组腺相关病毒表达载体。方法: 利用限制性内切酶切相应载体后将Apoptin和HA2TAT连入pUC19/NT4质粒, 再将融合基因NT4ApoptinHA2TAT亚克隆至腺相关病毒的穿梭质粒内, 与辅助质粒pAAV/Ad、腺病毒质粒pFG140共同转染HEK293细胞, 通过同源重组获得NT4ApoptinHA2TAT重组腺相关病毒载体, 收集病毒上清, Dot blot法测定其滴度。MTT比色法观察NT4ApoptinHA2TAT重组腺相关病毒表达载体, 对HepG2细胞存活率的影响。结果: 经酶切及测序证实克隆出NT4ApoptinHA2TAT融合基因; 得到高滴度的(×1015 pfu/L)重组腺相关病毒表达载体。NT4ApoptinHA2TAT重组腺相关病毒表达载体, 对HepG2细胞有强烈的诱导凋亡作用, 与对照组比较, 处理组细胞的存活率明显降低。结论: 通过分子克隆体外重组技术成功制备了NT4ApoptinHA2TAT重组腺相关病毒载体, 为下一步的Apoptin应用于基因治疗奠定了基础。
【关键词】 NT4
ApoptinHA2TAT 重组腺相关病毒肿瘤融合基因
近年来不损伤正常细胞的蛋白质和相关肽的发现为肿瘤的基因治疗带来了转机, 利用重组腺病毒转导这类基因, 注射实体瘤之后, 可以在一个较长的时间内持续表达杀伤肿瘤的蛋白[1]。体外合成或基因工程表达的CAVVP3蛋白Apoptin能特异地诱导多种人源性恶性肿瘤细胞的凋亡, 但对正常二倍体体细胞无作用[2]。本研究在前期工作的基础上拟构建神经生长因子4(NT4)信号肽引导的可分泌表达ApoptinHA2TAT的重组腺相关病毒高效表达载体, 为下一步进行Apoptin应用于基因治疗奠定基础。
1 材料和方法
材料克隆载体pGEMT/Apoptin质粒有本课题组构建[3]; 限制性内切酶NaeⅠ、 XhoⅠ、 EcoRⅠ、 SalⅠ购自宝泰克生物公司; Taq DNA聚合酶、 T4 DNA连接酶购自华美生物公司; pUC19/NT4质粒、 pGEMT/HA2TAT、腺病毒穿梭质粒pSSCMV及辅助质粒pAAV/Ad、腺病毒质粒pFG140, 大肠杆菌DH5α及293细胞系、小鼠成纤维细胞NIH3T3、 HepG2人肝癌细胞系均由西安华广生物工程公司提供。
方法
pUC19/NT4ApoptinHA2TAT载体构建碱裂解法大量制备重组质粒pGEMT/Apoptin、 pGEMT/HA2TAT, 分别用限制性内切酶NaeⅠ、 KpnⅠ、 XhoⅠ消化, 切取Apoptin、 HA2
TAT用T4 DNA连接酶连入带有相同末端的已线性化pUC19/NT4载体。 DH5α菌株, 随机挑选单个菌落, 接种于含有氨苄西林的LB培养基内, 37℃增殖培养, 碱裂解法小量提取质粒