文档介绍：P6BMP2的克隆及其在大肠杆菌中的表达
(作者:___________单位: ___________邮编: ___________)
【摘要】目的:在大肠杆菌中克隆和表达骨形态发生蛋白2(BMP2)的变体P6BMP2并初步纯化。方法:根据P6肽的氨基酸序列,按照大肠杆菌偏爱密码子将P6肽的核酸序列设计在5′端引物,通过PCR方法合成P6BMP2基因,并将其克隆到大肠杆菌表达质粒pALEX中,经NcoⅠ、XhoⅠ双酶切和DNA序列测定验证。结果:通过双酶切和DNA序列分析,证实获得的基因片段与我们期望的相符合,重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导获得表达。表达产物经超声破碎和Heparin SepharoseTM 6 Fast Flow亲和层析纯化,获得重组蛋白。结论:构建了P6BMP2的表达质粒,获得P6BMP2的表达并建立了纯化方式,为P6BMP2的深入研究和应用奠定了坚实的基础。
【关键词】骨形态发生蛋白;P6;P6BMP2;大肠杆菌;胶原蛋白;表达
自1965年Urist[1]发现骨基质中含有能够诱导异位成骨的骨形态发生蛋白(bone morphogenefic protein,BMP)以来,研究者们经过大量动物实验和临床应用研究证实,BMP能在非骨组织如肌肉中诱导形成软骨和骨,是一种高效的骨诱导蛋白,其中BMP2被认为是活性最强的唯一能单独诱导骨形成的因子[2]。由于越来越多的实验证实了BMP2在诱导骨形成和骨修复方面的高效性及安全性,人们开始将其应用于骨科临床,并得到了令人满意的疗效[3
6]。另一方面,在骨缺损的修复重建过程中,成骨细胞产生的Ⅰ型胶原具有特定的引导骨组织修复再生的生物学特性,在促进成骨细胞的粘附、增殖和分化同时,对破骨细胞的吸收也有一定作用。这些功能据推测与其分子结构中含有特定的细胞识别信号有关[7],Bhatnagar等[89]发现在Ⅰ型胶原α链中含有有效细胞结合位点,为一段15个氨基酸序列的细胞结合肽,其与ABM(无机骨粒)相结合可模拟骨细胞外基质成分,促进骨再生。Bhatnagar[10]以此为基础,发明了一组用来模拟Ⅰ型胶原蛋白细胞连接域的肽段,IleAla是其核心序列,呈现β弯曲构象。P6肽是其中的一种,其序列是GlnGlyIleAlaGlyGln。周炳荣等[11]的研究显示,P6肽能够刺激人骨髓间充质干细胞的增殖;杨旭东等[12]则将P6肽和无机骨粒复合用来治疗骨缺损,结果显示该复合物具有较强的促进骨缺损修复能力。这些都表明P6肽具有一定的促进间充质干细胞增殖,加快骨组织修复和再生的能力。为了将BMP2和胶原蛋白在引导骨组织修复或再生中的功能结合起来,我们构建了P6BMP2融合蛋白,希望这个融合蛋白可以提高骨形成能力。
1 材料与方法
材料
菌株 10和表达菌株BL21(DE3) 均由本实验室保存。
基因和质粒 pALEX和pCI
BMP2由本实验室保存。
酶及化学试剂各类限制性内切酶、T4 DNA 连接酶、Taq聚合酶等购自Takara公司;RNasin购自Promega公司;引物片断由上海博彩生物公司合成;柱离心胶回收试剂盒购自华舜公司;Heparin Seph