文档介绍：RTPCR检测人膀胱上皮细胞双功能氧化酶表达
(作者:___________单位: ___________邮编: ___________)
作者:耿会珍刘明岩赵丽君刘珍刘燕翔黄宁王伯瑶吴琦
【摘要】目的:检测人膀胱上皮细胞(T24细胞)是否表达双功能氧化酶(Duox1、Duox2),并观察炎症细胞因子及佛波酯(PMA)对基因表达水平的影响。方法:体外培养人膀胱上皮(T24)细胞,经佛波酯(PMA)、炎症细胞因子(TNFα及IFNγ)刺激后提取细胞总RNA,采用半定量RTPCR方法观察细胞Duox1,Duox2 mRNA表达水平。结果:Duox1,Duox2 mRNA在T24细胞中组成性表达,在佛波酯(PMA)、TNFα及IFNγ作用下,Duox2基因表达水平明显增加,而Duox1基因表达水平无明显变化。结论:双功能氧化酶Duox1和Duox2基因在膀胱上皮细胞表达,并受炎症刺激的影响,其在膀胱上皮细胞中的生理功能值得深入研究。
【关键词】膀胱上皮细胞;双功能氧化酶;基因表达
吞噬细胞NADPH氧化酶被激活后,细胞发生呼吸爆发,产生大量活性氧(ROS),成为细胞杀灭微生物的重要成分。2000年以后,在非吞噬细胞发现了NADPH氧化酶的同源物家族,被命名为NOX(NADPH oxidase)家族。人类NOX家族共有7个成员,即NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5、Duox1和Duox2[1-3]。NOX家族广泛表达于机体的组织器官,其生物学功能成为研究的热点。双功能氧化酶(Duox1和Duox2)最初在甲状腺中发现,它们除了具有NOX的C端结构域外,还有一个N端过氧化物酶样胞外域,故称为双功能氧化酶。近年来,呼吸道、胰腺、腮腺、前列腺及肠胃道上皮等部位陆续发现Duox基因表达。泌尿道上皮是否表达Duox目前未见文献报道,本实验利用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)的方法,观察膀胱上皮细胞中是否存在Duox表达,并初步探讨基因的表达调控因素。
1 材料与方法
材料人膀胱上皮细胞株(T24)为本实验室保存,RPMI1640为GIBCO产品,新生小牛血清购自兰州民海生物工程有限公司,佛波酯(PMA)购自sigma公司,细胞因子(TNFα、IFNγ)为PeproTech公司产品,Trizol试剂购自Invitrogen 公司,逆转试剂盒购自MBI公司,Taq mix DNA聚合酶,DL2000 DNA Marker为天根生物技术有限公司产品,PCR引物由Invitrogen 公司合成。
方法
细胞培养及刺激 T24细胞采用含有10%新生小牛血清的1640培养基(无抗生素)常规培养和传代。实验前在每个细胞培养皿(60×15mm)中接种30万个T24细胞,37℃ 5%CO2孵箱培养24h。加入PMA(浓度为5nM)或细胞因子(TNFα 20 ng·ml-1+IFNγ 20 ng·ml-1),分别在刺激后的12、24h收集细胞抽提RNA。实验同时设无刺激的空白对照组。
PCR引物设计根据GenBank 的序列,1(登录号AF213465),Duox2 (登录号AF267981),βactin