文档介绍：1CRISPR-Cas系统的研究进展CRISPR(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats),即串联的、间隔的短回文重复序列,最早在1987年研究大肠杆菌的碱性磷酸酶基因时被发现[1]。随后在细菌和古细菌的基因组中也发现大量存在CRISPR,研究证实它能够保护自身抵御外来病毒和质粒的入侵[2],作用机制是依靠crRNA(CRISPRRNA)和tracrRNA(trans-activatingcrRNA)结合并引导Cas蛋白对外源DNA进行特异性降解[3]。已发现的CRISPR-Cas系统有三种类型:Ⅰ型,Ⅱ型和Ⅲ型,其中以Ⅱ型最为简单,只需一种Cas蛋白,即通过RNA介导核心蛋白Cas9识别并切割靶序列,引起DNA双链断裂[2]。受自然界中CRISPR-Cas系统的启发,主要对来自于化脓性链球菌(uspyogenes)的Ⅱ型CRISPR-Cas系统进行人为改造和利用,目前已经将其发展成为一种新型的基因编辑技术,实现基因敲除、插入、定点突变和组合编辑[4],并成功应用于大肠杆菌、酿酒酵母、家蚕、果蝇和人类细胞等[5]。和传统的基因编辑技术相比,这一新技术具有成本低、操作简便、效率高的优点[6]。2CRISPR-Cas系统的组成与机制典型的Ⅱ型CRISPR-Cas系统基因座包含tracrRNA基因、Cas蛋白编码基因(cas9、cas1、cas2和csn2)、CRISPR基因座(引导序列、间隔序列和重复序列)这三个部分[6]。Ⅱ型CRISPR-Cas系统的作用机制可分为三个阶段,第一是高度可变间隔序列的获得(图1),第二是CRISPR-Cas系统基因座的表达,第三是对外源遗传物质的降解[6](图2)。Cas1、Cas2和Csn2蛋白与新间隔序列的获得相关。与间隔序列同源的外源遗传物质上的原间隔序列(protospacer),其下游存在一段保守序列,被称为PAM(protospaceradjacentmotifs)[7]。当外源噬菌体或质粒首次入侵时,宿主菌通过识别PAM,选取合适的原间隔序列,切割并整合到CRISPR基因座中,形成新的间隔序列。正常情况下CRISPR基因座的表达水平很低[8],但是当外源噬菌体或质粒再次入侵时,CRISPR基因座的表达水平快速上调,首先转录形成前体crRNA(pre-crRNA),随后在tracrRNA的指导下,由Cas9和核酸内切酶RNaseⅢ加工为含有一个间隔序列和部分重复序列的成熟crRNA。成熟的crRNA与tracrRNA形成crRNA:tracrRNA复合物,并结合Cas9形成核糖核蛋白复合物,crRNA上的间隔序列与外源DNA的原间隔序列互补配对,从而引导具有核酸内切酶活性的Cas9对DNA双链进行特异性切割。图1宿主菌获得新间隔序列的机制[6]Ⅱ型CRISPR-Cas系统表达及降解外源遗传物质的机制[6]-strandbreak3双质粒CRISPR-Cas9基因敲除系统本实验中采用双质粒CRISPR-Cas9系统[5]对大肠杆菌进行“无痕”基因敲除,涉及到的两个质粒分别为pCas和pTa