文档介绍：、(每克组织3mlRIPA),PMSF(每克组织30μl,10mg/mlPMSF),利用Polytron进一步匀浆(15,000转/分*1分钟)维持4℃(每克组织30μl,10mg/mlPMSF),℃约20,000g(约15,000转)-20℃(体积*蛋白质浓度),并加等体积的2×(浓缩胶20mA,分离胶35mA)(100mA40分钟),。1)转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜,将硝酸纤维素膜铺在凝胶上,用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。2)在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸(预先用转移缓冲液浸湿),将凝胶夹在中间,保持湿润和没有气泡。3)将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中,凝胶面向阴极。4)将上述装置放入缓冲液槽中,并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。5)按照厂家所示接通电源开始电泳转移。6)转移结束后,取出薄膜和凝胶,弃去凝胶。,直至分子量标准显现时取出,记录下标准位置。,必要时可用脱色缓冲液。℃保温1小时。,用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。,尽可能不留空气。,用透析袋夹紧。:NGS(100微升),印迹缓冲液中的抗体(10毫升),加在装薄膜的袋中,于室温下摇动2小时(或4℃过夜)-Tween缓冲液,分4次在一浅盘中洗涤薄膜,每次75ml。(40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS)加在袋内,于室温下摇动1小时。。-HRP(40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS),于室温下摇动。注意事项:westernblot中转移在膜上的蛋白处于变性状态,空间结构改变,因此那些识别空间表位的抗体不能用于westernblot检测。这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化,再用酶标记亲和素进行westernblot。实验中取胶和膜需带手套。Western实验步骤Western,也称Westernblot、Westernblotting、Western印迹,是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western可以参考如下步骤进行操作。(Proteinsamplepreparation)O可以使用适当的裂解液,例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液,裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白,例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等,可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白,也可以使用试剂盒进行抽提,例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒。O收集完蛋白样品后,为确保每个蛋白样品的上样量一致,需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同,需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液,可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。(Electrophoresis)(1)SDS-PAGE凝胶配制OSDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制,也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒。该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。(2)样品处理O在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积,在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制,也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)。O100℃或沸水浴加热3-5分钟,以充分变性蛋白。(3)上样与电泳O冷却到室温后,把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。O为了便于观察电泳效果和转膜效果,以及判断蛋白分子量大小,最好使用预染蛋白质分子量标准。O电泳时通常推荐在上层胶时