文档介绍：Western blot操作步骤
BCA法测定蛋白质含量
,利用酶标仪建立蛋白标准曲线;
,以计算出合理的上样量。
SDS-PAGE凝胶电泳
按装模具:取两块玻璃板( mm厚度),洗净风干后,安装玻璃板,确保下端对齐,不漏液。
制备分离胶,分离胶浓度依据所测蛋白分子量来确定。
分离胶的灌注:凝胶混匀后,灌入已安装好的玻璃板中,至玻璃板上缘约2cm左右止,缓缓加入超纯水,覆盖在分离胶顶部,防止因氧气扩散进入凝胶而抑制聚合反应,室温聚合。
配制浓缩胶,待分离胶聚合后,倒去超纯水,并用滤纸吸干残留的液体,灌制浓缩胶。
浓缩胶灌到已聚合的分离胶之上,保持短玻璃板齐平,并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子,在此过程中应避免气泡的产生,室温聚合。
浓缩胶完全聚合后,小心拔出梳子,凝胶玻璃板固定于电泳装置上,放入电泳槽内。在内外槽内加入1×SDS电泳缓冲液,使电泳装置底部的电极丝完全浸入缓冲液中。
样品准备:样品中加相应的上样缓冲液,放入沸水中加热3-5 min,然后上样。
电泳:上样完成后,接通电源。浓缩胶部分保持恒压80 V,分离胶保持120V,电泳至溴酚蓝到达分离胶的底部时停止。
Western blot (免疫印迹法检)
电泳结束后,从电泳装置上卸下玻璃板,取出凝胶。去除上层的浓缩胶,将凝胶置于转移缓冲液中浸泡
30 min;
准备与胶同样形状、大小的PVDF膜和2张滤纸,将膜和滤纸置于转移缓冲液中浸泡20 min。(PVDF膜必须先在甲醇溶液中浸泡激发);
湿转:将凝胶、PVDF膜、滤纸、棉垫在转移缓冲液中充分浸泡后进行三明治叠板(由负极到正极依次为,棉垫-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-棉垫);
接通电源,所转膜蛋白的分子量设置电压,开始转膜(转膜过程在冰浴环境中)。
免疫检测
将转好的PVDF膜放入培养皿中,加入适量的封闭液,在4℃冰箱中过夜(或室温封闭2 h);
按抗体的效价用5%的BSA(或封闭液)稀释抗靶蛋白特异性抗体(一抗)。
孵育和盒内一抗反应2~3 h,室温(也可4℃冰箱中