文档介绍：:..Westernblot操作步骤实验原理:   Westernblot,也称Westernblotting、蛋白印迹,是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Westernblot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如PVDF膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。内参:     WB过程监测以及目的蛋白定量的标准;最重要和最不可或缺的对照就是内参照。,如果一个实验连内参照都出不了阳性结果的话(在内参抗体有效的情况下),那么这个体系就是存在问题的;2、起半定量的标准的作用,内参一般选择管家基因编码表达的蛋白,在很多组织和细胞中都是稳定表达的,因此可以作为检测靶蛋白表达量的标准;内参名称分子量大小适用范围beta-actin43kDa胞浆和全细胞GAPDH30-40kDa胞浆和全细胞Tubulin55kDa胞浆和全细胞VCDA1/Porin31kDa线粒体COXIV16kDa线粒体TBP38kDa细胞核  实验步骤一、蛋白样品制备(组织中总蛋白的提取)    第一步:    法(1)-+400-500ul裂解液,放入打样管,放入打样机打样。    法(2)实验室研钵研磨:,加少量液氮冻硬,用研杵来回研磨至粉末状,用枪头刮取收集入离心管。注:任何操作都要在液氮中进行,并且要将枪头和离心管提前泡在液氮中。第二步:取出的样品放置冰上1-2h(中间混匀5-6次)直至裂解完全。第三步:样品离心×2,取上清于新的EP管中。(离心条件:13000rpm,4℃,30min)注:离心机提前预冷至4℃。二、蛋白含量的测定    第一步:在96孔板第一列1-8分别为浓度为0,1,2,4,6,8,9,10倍的蛋白标准液+水=10或20ml,再加上5倍稀释的考马斯亮蓝染液200ml。第二步:在96孔板后面几列依次加入稀释的蛋白样品或原液10-20ml以及5倍稀释的考马斯亮蓝染液200ml。注:原液浓度太高时进行稀释,用裂解液稀释。三、电泳   第一步:清洗玻璃板将玻璃板在蒸馏水下冲洗干净,去除杂质,再用去离子水清洗一遍,自然晾干。第二步:配胶   (1)玻璃板对齐后放入夹中卡紧,然后垂直卡在架子上准备灌胶。       (2)配分离胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。待胶面升到玻璃板3/4位置时即可。然后胶上加一层水,液封后的胶凝固更快。注:加水液封时须缓慢,否则胶会被冲变形。   (3)当水和胶之间有一条折射线时,说明胶已凝固。倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。配浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶,然后将梳子插入浓缩胶中。待到浓缩胶凝固后,两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。注:插梳子时要