单克隆抗体制备实验过程.doc

文档介绍：单克隆抗体制备实验过程一、免疫动物免疫动物是用目的抗原免疫小鼠,使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠,按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官,刺激相应B淋巴细胞克隆,使其活化、增殖,并分化成为致敏B淋巴细胞。说明:FCA,弗氏完全佐剂;FIA,弗氏不完全佐剂;Quickantibody,北京康碧泉公司研制的佐剂。上表中第四种免疫方法产生的抗体大部份都为IgM,存在亲和力弱等缺点,慎用。PS:1、一般皮下注射每个注射点注射30-50ul左右混有佐剂的抗原,每只小鼠注射6-8个点为宜。2、腹腔注射时,如果抗原混有弗氏佐剂,建议注射在左侧腹腔,如果采用右侧腹腔注射,则在免疫过程中,很容易导致小鼠脾脏与腹膜粘连的情况,造成后期取出脾脏麻烦。3、冲击免疫完成后,应在96小时内完成细胞融合,否则相应的B细胞数量会下降到未冲击前的水平。二、细胞融合(Cellfusion)【材料和试剂】(1)骨髓瘤细胞悬液选好骨髓瘤细胞株,取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞,制备细胞悬液。(2)免疫小鼠脾细胞悬液取3天前加强免疫的小鼠,眼眶放血,分离血清冻存备用。拉颈处死小鼠,浸泡于75%酒精中3~5min。无菌操作取出脾脏,置入盛有5ml不完全培养液的平皿中洗涤,剪去周围的结缔组织,将脾脏移入另一盛有5ml不完全培养液的平皿中的钢网上,先用剪刀剪成3~5个小块,然后用注射器内芯研磨。将脾脏细胞悬液移至50ml离心管中,加不完全培养液50ml,1000r/min离心5min,弃上清,再以同法洗涤离心一次。然后将沉淀细胞重新悬浮于10ml不完全培养液中,计活细胞数,~2×108个脾细胞。饲养细胞将小鼠致死、体表消毒和固定后,用消毒剪镊从后腹掀起腹部皮肤,暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射10ml不完全培养基至腹腔,注意避免穿入肠管。右手固定注射器,使针头留置在腹腔内,左手持酒精棉球轻轻按摩腹部1分钟,随后吸出注入的培养液。1000r/min离心5-10分钟,弃上清。先用5mlHAT培养基将沉淀细胞悬浮,根据细胞计数结果,补加HAT培养基,使细胞浓度为2×105/ml,备用。主要试剂的配制①细胞培养基杂交瘤技术中使用的细胞培养基主要有RPMI-1640或DMEM(odifiedEaglesMedium)两种基础培养基,配好后过滤除菌(),分装,4℃保存。不完全RPMI-1640培养基:RPMI-1640培养基原液96ml100×%NaHCO3溶液1-2mlHEPES溶液1ml不完全DMEM培养基:×-,过滤除菌,分装4℃保存。完全RPMI-1640或DMEM培养基:不完全RPMI-1640或DMEM培养基80ml小牛血清15-20mlHT或HAT培养基:HT培养基HAT培养基完全RPMI-1640或DMEM培养基99ml98mlHT贮存液1ml1mlA贮存液1ml②氨基喋呤(A)贮存液(100×,4×10-5mol/L)(),溶于90ml超纯水或四蒸水中,滴加1mol/,再补加超纯水或四蒸水至100ml。过滤除菌,分装小瓶(2ml/瓶),-20℃保存。③次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷(HT)贮存液(100×,H:10-2mol/L,T:×10-3mol/L)(Hypoxanthine,)(Thymidine,),加超纯水或四蒸水至100ml,置45-50℃水浴中使完全溶解,过滤除菌,分装小瓶(2ml/瓶),-20℃冻存。用前可置37℃加温助溶。④L-谷氨酰***(.)溶液(100×,)-谷氨酰***(L-glutamine,),用100ml不完全培养液或超纯水(或四蒸水)溶解,过滤除菌,分装小瓶(4-5ml/瓶),-20℃冻存。⑤青、链霉素(双抗)溶液(100×)取青霉素G(钠盐)100万单位和链霉素(硫酸盐)1g,溶于100ml灭菌超纯水或四蒸水中,分装小瓶(4-5ml/瓶),-20℃冻存。⑥%,溶于100ml超纯水或四蒸水中,过滤除菌,分装小瓶(4-5ml/瓶),盖紧瓶塞,4℃保存。⑦HEPES溶液(1mol/L)(N-2-Hydroxyethylpiperazi