影响根癌农杆菌eha105感受态细胞转化效率因素的研究.doc

文档介绍：影响根癌农杆菌EHA105感受态细胞转化效率因素的研究Vol,3No,)7054(20120)1)0022)05:1674文章编号EHA105影响根癌农杆菌感受态细胞转化效率因素的研究,,,,,高世武郭晋隆阙友雄许莉萍杨颖颖陈如凯(,350002)福建农林大学农业部福建甘蔗生物学与遗传育种重点开放实验室福建福州:EHA105,;CaCl48h摘要通过对菌株不间断培养观察绘制出其生长曲线图同时用不同浓度的溶液分2EHA105,,别制备根癌农杆菌的感受态细胞在转化过程中用不同的温度进行热激处理统计分析阳性转化。,,DNAEHA105子个数明确了采用冻融法将外源导入农杆菌时的几个影响因素的参数结果表明当OD1,0:1,5,EHA105,;,CaCl值在之间时根癌农杆菌正处在对数生长期活力最强制备感受态细胞时6002)1)16:10mmol?Lmmol?L5,322×10?6,,10,溶液的浓度在之间无显著差异但以效果最佳转化率达)16)g,20:37?,37?,5,550×10g?μ热激处理温度在之间均无显著差异但处理时转化率最高达μ1。:EHA105;;;关键词根癌农杆菌生长曲线冻融法转化率:Q78:A中图分类号文献标志码,1,1985HORSCH,自从年等发明了农杆菌介导的烟草叶盘转化法以来农杆菌介导的基因转化技术。,、、、、得到了快速发展通过农杆菌介导获得转基因植物的报道也越来越多如水稻玉米小麦棉花西红柿,2)6,。(Agrobactriumtumefaciens)1,1Ti(,等根癌农杆菌是种革兰氏阴性土壤杆菌含有种环形的质粒200kb),1T-DNAvir,,T-DNA该质粒含有段和基因当其侵染植物细胞后能将其插入到被侵染细胞的基,7,,,DNA。因组中并能稳定遗传给后代可作为外源进入植物细胞的载体但在农杆菌介导的基因转化过,1。程中将携带外源基因载体质粒导入农杆菌是第个限速步骤目前将重组质粒导入农杆菌的方法有多,8,,。,,,2d,;种但都存在着一些弊端例如三亲杂交法其操作繁琐转化过程长达并且需要辅助质粒电激,9,,10,,;,,转化法需要昂贵的仪器和耗材转化条件严格相比之下冻融法虽然转化效率低但由于其操作简,,,。单不需昂贵的仪器和耗材因此在普通实验室中得到了广泛的应用、、影响冻融法转化效率的主要因素有农杆菌的生长状态感受态细胞的质量转化时的热激温度,11)14,,,。,等由于培养基及农杆菌菌株不同等原因各文献报道的优化条件有所不同为此本试验以根癌EHA105CaCl,,,农杆菌为受体细胞并用多梯度不同浓度的处理使其处于感受态然后使用本实验室自2p2AST2301DNA,EHA105、己构建的植物表达载体质粒进行转化分析根癌农杆菌的生长状态不同浓度CaClEHA105,所制备感受态细胞的质量以及转化时的热激温度对根癌农杆菌转化效率的影响筛选出2,EHA105。具有较高转化效率的优化条件旨在为根癌农杆菌介导的基因转化试验提供参考依据1材料与方法1,1材料1,1,1(Agrobactriumtumefaciens)EHA105菌株及质粒根癌农杆菌菌株由农业部甘蔗遗传改良重点开2011)12)01:收稿日期:(30871581);863863“”基金项目国家自然科学基金项目国家高技术研究发展计划项目(2007AA100701);(F2007AA100701);福建省科技厅国家科技项目现代农业产业技术体系建设专(nycytx)项资金项目024)01)06):(1982)),,,作者简介高世武男河南南阳人福建农林大学农业部福建甘蔗生物学与遗传育种重点开放实验cry2A,NPTgus,,p2AST2301,,放实验室提供植物表达载体由本实验室自己构建含有?等基因具有卡那。霉素抗性)1)1)11,1,2YEB:Yeastextract1,0gL;Beefextract5,0gL;Tryptone5,0gL;???培养基培养基成分)1)1)1MgSO7HO4gL;Sucrose5,0gL;pH7,4(gL)。???5?固体培养基中含的琼脂粉421,2试验方法,15,1,2,1EHA105,YEB,农杆菌菌株生长曲线的建立根据细菌生长曲线测定的方法使用培养基对EHA105(OD),,,农杆菌菌株进行整个生长过程的观测测定其吸光值绘制其生长曲线以确定其活力最600。强的时期+)1YEB(Rif35mgL)?EHA105,20mL从含平板上挑取新鲜培养的农杆菌菌株的单菌落接种到)1YEB,28?,200r?min1,50,OD,。液体培养基中振荡培养过夜使其值达到左右作为母液试验共设600+)125Rif(35mgL),3。?YEB。7550mL个处理每个处理重复次利用含有的液体培养基作参照