文档介绍：山东农业大学
硕士学位论文
J亚群禽白血病病毒和禽网状内皮组织增生症病毒单克隆抗体的
研制
姓名:王峰
申请学位级别:硕士
专业:基础兽医学
指导教师:成子强
2011-06-13
山东农业大学硕士学位论文
摘要
禽白血病和网状内皮组织增生症均可引起禽类肿瘤和免疫抑制性疾病。这两种禽
肿瘤病都可导致不同程度的二重感染、多重感染及继发感染,减弱鸡群对各种疫苗的
应答能力,加剧某些疾病的临床表现。目前,对禽白血病和禽网状内皮组织增生症尚
无有效的药物治疗,也没有疫苗可以进行预防,世界各国主要通过抗原/抗体检测,
淘汰阳性鸡,净化种群等防制措施来控制这两种禽肿瘤病。
ALV-J gp85 基因编码的表面蛋白(SU)是病毒囊膜蛋白的重要组成成分,有许
多病毒抗原位点,也是亚群区分的主要蛋白,是检测亚群特异性抗体的首选抗原。
REV env 基因编码 SU 和跨膜蛋白(TM)。本课题分别以 ALV-J 中国株 WS0705
和 REV 原型株 SNV 株为标准株,选取了 1200bp 相对保守的 env 基因序列,包涵该
段基因表达 REV 病毒 90%以上的抗原位点,既保证了基因的保守性又保留了良好的
抗原性。本将含有 ALV-J gp85 基因重组质粒 pProExHTB-gp85 转化入 BL21 宿主菌,
将含有 REV env 基因的重组质粒 pET-28a-env 转化入 BL21(DE3)宿主菌,分别优
化诱导表达条件,诱导表达产物经 SDS-PAGE 电泳,分别在在 35KD 处和 45KD 处出
现目的蛋白。采用尿素法纯化大量表达的蛋白包涵体,通过透析法恢复蛋白的天然构
象和蛋白活性。测定纯化蛋白浓度后进行 ELISA 和 Western-blot 检测,结果显示
ELISA 检测灵敏性能达到 100ng/mL,表达的两种蛋白都具有良好的灵敏性和特异
性。
以纯化的 His-gp85 蛋白和 His-env 蛋白为抗原免疫新西兰大白兔制备多克隆抗
体, 免疫剂量为 300µg/只,免疫 3 次采后通过 ELISA 和 IFA 试验测定了所获得的多
抗效价,ELISA 测得效价分别达到 1:100 万和 1:200 万,IFA 测得效价分别高于
1:3200 和 1:12800。
以纯化的 His-gp85 蛋白和 His-env 蛋白为抗原免疫 6 周龄的 Balb/c 纯系小鼠,
40µg/只,免疫 3 次,采血,建立间接 ELISA 方法和 IFA 法测定血清抗体效价。取血
清效价高的 Balb/c 小鼠脾细胞与 SP2/0 骨髓瘤细胞在 PEG1500 的作用下进行细胞融
合。用 HAT 选择培养基对杂交瘤细胞进行培养,当杂交瘤细胞集落布满孔底 1/4 -
1/2 时,取细胞上清作抗体效价检测。采用有限稀释法对阳性孔进行亚克隆,重复 3
次以上,直到取得能稳定分泌抗体的单克隆细胞株。得到抗 ALV-J 病毒单克隆细胞
两株分别命名为 1D3 和 3B1,ELISA 检测细胞上清抗体效价均为 1:1024;得到抗
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J 亚群禽白血病病毒和禽网状内皮组织增生症病毒单克隆抗体的研制
REV 病毒单克隆细胞株一株命名为 4D5,ELISA 检测细胞上清效价为 1:2048,并进
行腹水制备,并通过 ELISA 和 IFA 试验测定了所获得的单抗腹水的效价,ELISA 效
价为 1:40 万,IFA 效价为 1:6400;腹水又经 SDS-PAGE、Western-blot 等法的综合检
测表明所得单抗具有良好的特异性。
本研究的完成为制备 ALV-J 和 REV 抗体/抗原 ELISA 检测试剂盒的国产化奠定
了基础;为快速、准确诊断两种禽肿瘤病、保障我国禽业的健康持续发展提供技术支
持。
关键词:禽白血病病毒 J 亚群;禽网状内皮组织增生症病毒;原核表达;蛋白纯
化;多克隆抗体;单克隆抗体

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山东农业大学硕士学位论文

Preparation and Identification of the Monoclonal
Antibodies against Avian Leukosis Virus (Subgroup J) and
Reticuloendotheliosis Virus
Abstract
Avian Leukosis and reticuloendotheliosis are both diseases can cause avian tumors and
immunosu