文档介绍：分类号 学校代码 10129
U D C 578 学号 2009301032
H9N2 亚型禽流感病毒与鸭坦布苏病毒的生物学特性研究
及疫苗的初步研制
Characteristics of H9N2 Avian Influenza Viruses and Duck Tembusu Viruses
and Primary Development of ines Against the Diseases
Caused by These Viruses
申请人: 徐大伟
学科门类: 农学
学科专业: 临床兽医学
研究方向: 奶牛疾病及宠物疾病的研究
指导教师: 李云章教授
李泽君研究员
论文提交日期:二〇一二年十月
摘要
H9N2 亚型禽流感病毒在全世界流行广泛,危害巨大。通常该亚型禽流感病毒为
低致病性,感染禽类后不会引起大批死亡。但最近发现感染该亚型病毒的禽类死亡率
很高,应用多聚酶链式反应(PCR)方法诊断,发现感染本病禽类脏器中同时存在 H9N2
亚型禽流感病毒和新发现的鸭坦布苏病毒。基于此问题,本研究分别对 H9N2 亚型禽
流感病毒和鸭坦布苏病毒的生物学特性进行了深入研究,并对预防这两种病毒的疫苗
进行了初步探讨研究。
为掌握我国 H9N2 亚型禽流感病毒流行株的生物学特性,本研究选取 2003~2010
年分离到的 27 株病毒进行了系统深入的研究。遗传演化分析发现我国 H9N2 亚型禽流
感病毒的遗传演化复杂,部分毒株 PA 和 NS 基因与 H9N2 亚型禽流感病毒参考序列的
同源性均不高,表明这些基因可能来源于其它亚型的流感毒株,序列分析发现 H9N2
亚型禽流感病毒近期分离株的基因片段主要起源于 Ck/Shanghai/F/98(H9N2)株。交
叉血凝抑制实验及病毒中和实验表明近年来我国 H9N2 亚型禽流感病毒的抗原性发生
了明显的改变。对 BALB/c 小鼠致病性实验说明我国 H9N2 亚型禽流感病毒对小鼠的致
病能力呈现下降趋势,尤其是 2006 年后的病毒分离株在小鼠体内的复制能力明显低
于早期分离株。挑取处在不同进化分支的 4 株 H9N2 亚型禽流感病毒对 4 周龄 SPF 鸡
进行了鼻腔接种致病性实验,发现这些毒株主要在感染鸡的气管和肺脏中增殖,但不
出现明显症状。
根据上述抗原性分析结果,从 H9N2 亚型禽流感病毒分离株中筛选出一株病毒
Ck/Shanghai/441/09(H9N2)(简称 Ck441)进行了初步的疫苗(免疫学)研究。Ck441
病毒尿囊液灭活后制备灭活(毒株)疫苗,免疫 4 周龄 SPF 鸡,免疫 3 周后,用 Ck441
和一株 2011 年 H9N2 亚型禽流感病毒分离株进行攻毒实验,发现免疫组鸡均不发病、
不排毒,而对照组鸡 100%排毒,表明 Ck441 是一株理想的疫苗候选株。为提高病毒
株的在细胞上的增殖能力,把 Ck441 的 HA 和 NA 插入到 pBD 载体 SapI 酶切位点之间,
分别拯救获得了 4 株重组病毒,通过鸡胚和细胞增殖实验,发现 441HANA/PR8-mutNS
在鸡胚和细胞上增殖滴度都很高,将该株病毒经鸡胚和细胞扩增、灭活后制备灭活疫
苗并免疫 SPF 鸡,都能够达到 100%的保护率。
鸭坦布苏病毒是 2010 年 4 月以来引起鸭产蛋量下降、生长阻滞甚至死亡的新发
鸭传染性疾病的病原,为获得此病毒对哺乳动物和鸡的致病信息,将鸭坦布苏病毒奉
贤分离株(FX2010)人工感染 BALB/c 小鼠和 SPF 鸡。经肌肉和腹腔注射接种小鼠,
各组织脏器均没检测到病毒;经鼻腔接种小鼠,FX2010 病毒可在 BALB/c 小鼠的肺脏
中复制增殖;脑内接种,BALB/c 小鼠出现明显的临床症状,被毛逆立,体重下降,
在小鼠的脑和肺脏中均可分离到病毒,随着接种病毒量的增加,小鼠体重下降更加明
显;经 8d 后,脑内病毒含量仍然很高,而肺脏中的病毒含量明显降低。FX2010 经肌
肉和鼻腔接种 2 周龄 SPF 鸡,经鼻腔接种鸡体重增长明显减缓,肌肉接种体重变化与
对照组无明显差异。病毒分离发现,经鼻腔和肌肉接毒的鸡在多个脏器均可分离到病
毒;FX2010 病毒经鼻腔接 SPF 产蛋鸡,实验组鸡排出绿色粪便,产蛋量呈现一过性
下降,部分脏器能够检测到病毒。在感染鸡的整个实验过程中,未见鸡严重发病或死
亡,表明该病毒对鸡呈现低致病性。
为初步研制防控鸭坦布苏病毒病的