文档介绍：葡聚糖凝胶过滤分离蛋白质
实验原理
实验材料与器材
实验步骤
实验原理
凝胶过滤层析利用有一定孔径的多孔的亲水性凝胶作为载体,当分子大小不同的混合物通过这种凝胶柱时,各物质在柱中存在两种运动,一是随洗脱液垂直向下移动,二是无定向的扩散运动。直径大于凝胶孔径的大分子,不能进人胶粒内部,便直接沿着胶粒间隙溶剂先流出,称为全排出);小分子物质,直径小于凝胶孔径,能自由进出能容纳下它们的孔穴,绕道而行,结果在柱中的保留时间增长而最后流出;中等大小的分子,能进人部分胶粒内部,从而在柱中的保留时间较大分子长,但较小分子短,中间流出。于是,流过凝胶柱的混合物按其分子大小W被分离。
混合物中某一被分离成分在一定的凝胶层析柱内的洗脱,通常用分配系数(Kd)来表示。其定义为:
Kd=(Ve一V0)/ Vi
Ve,某一被分离物成分被洗脱时所用洗脱液的体积
Vo,凝胶颗粒间自由空间的总体积
Vi,胶颗粒内部孔穴的总容积
大分子物质,其Kd=0,小分子能全部进人胶粒内的Kd=1,中等大小分子,Kd在O~1之间。
凝胶过滤法的分辨率(ρ)是凝胶层析中的另一个主要特征常数。从数学角度上可以表示为:
ρ=2(V2-V1)/(W1+W2) (≥1)
V2、V1,是两种被分离物的洗脱体积
W1、W2,是两个物质的洗脱峰的宽度。两个相的物质要想完全分离,ρ≥1。
实验材料与器材
胰蛋白酶(分子量为23KD)和牛血清白蛋白(分子量68KD)混合物、层析柱50cm×、核蛋检测仪、部分收集器、sephadex G一l50
实验步骤
:取干燥的Sephadex G一l5O浸泡在洗脱液
(本实验用蒸馏水,含5%的乙醇)中,充
分溶胀,注意不要过分搅拌,以防颗粒破
碎。为了缩短溶胀时间,可在沸水浴上加
热至将近1OO℃,还可以排除凝胶内部的
汽泡。
:将柱子及其附件清洗干净先将下口接好,加上缓
冲液,将出口处的汽泡排除,待柱内剩有2cm左
右液柱时,关紧流出口,将己溶胀好的凝胶的上
清液吸去,轻轻搅拌凝胶顺层析柱或玻璃棒一次
性倾倒入层析柱,待底部自然沉降有一定凝胶
后,打开流出口,直至凝胶沉积至所需高度。加
盖,并接上贮液瓶,开始滴注洗脱平衡液(本实
验用蒸馏水,含5%的乙醇)。至少要滴注2个柱
床体积的洗液,使胶床稳定。并检查柱子