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数字PCR技术在HER基因扩增检测中的应用要点.ppt

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数字PCR技术在HER基因扩增检测中的应用要点.ppt

上传人:s0012230 2016/3/15 文件大小:0 KB

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数字PCR技术在HER基因扩增检测中的应用要点.ppt

文档介绍

文档介绍:数字 PCR 技术在HER-2 基因扩增检测中的应用 HER-2 人类表皮生长因子受体(Human Epidermal growth factor Receptor ) 是一族具有酪氨酸激酶活性的高同源性蛋白质。该家族成员包括 HER-1 (EGFR )、 HER-2 、HER-3 和HER-4 EGER (又作 HER/ERBB )家族均通过接受特定种类生长因子的刺激从而激活酪氨酸激酶活性,启动细胞生长信号传递生长信号的增强均可导致细胞恶变。而生长信号的增强主要为受体蛋白的过量表达、信号传递蛋白突变,以及肿瘤本身辅以之的持续不断的生长因子自分泌。 HER-2 常与 EGFR 等生长因子受体蛋白二聚化,异源二聚化是EGFR 家族特征之一?正常的 HER-2 基因位于 17号染色体长臂上。于乳腺癌、卵巢癌等组织中常有高度的 HER-2 基因扩增与过度表达? HER-2 基因扩增的结果是这些肿瘤细胞表面 HER-2 蛋白表达增加,导致 HER-2 主导的生长信号通路过度活跃带有 HER-2 基因扩增的乳腺癌更易复发。相比 HER-2 扩增检测阴性的乳腺癌患者,阳性患者的恶化迅速,预后较差,生存期普遍缩短检测 HER-2 是否高表达对于患者的预后判断、治疗方案的选择具有重要意义, HER-2 基因的扩增比例是乳腺癌明确的预后指标和药物治疗效果的预测指标 HER-2 与乳腺癌常用靶向药物曲妥珠单抗(赫赛汀) 帕妥珠单抗赫赛汀等HER-2 靶向药物均对带有 HER-2 基因扩增的癌症组织有着显著的生长抑制能力,但其价格不菲所以——对HER-2 进行扩增检测对癌症病人的用药与治疗策略至关重要而检测方法的准确性则决定的该种检测方法在 HER-2 基因扩增检测上的地位检测目的检测方法?目前,《乳腺癌 HER2 检测指南(2011 版)》仍推荐 IHC 与FISH 和(或)CISH 相结合的检测策略?IHC( 免疫组织化学)直接针对细胞表面的 HER-2 ,快捷、便宜, 最接近事实。通常缺乏参考标准,对样本要求较高?FISH( 荧光原位杂交)为“金标准”,针对大片段 DNA ,但检测耗时、设备复杂且费用高昂。仍可能存在着假性结果?CISH( 色素原位杂交)针对 mRNA ,相比 FISH 更能反映蛋白表达程度,但不稳定。因信号单一而缺乏直观的对照 FISH IHC CISH 均可使用 ddPCR 进行绝对定量检测分子水平上的检测对象 HER-2 的扩增模式?HER-2 基因绝大多数在 17号染色体长臂上发生原位扩增,亦可能转座于其它染色体上。因维持染色体结构相对稳定, 染色体的着丝点及其邻近基因极少出现原位扩增?原位扩增是 HER-2 基因扩增的典型模式, FISH 法通过肉眼可直接观察到最真实的结果,是公认最常见的 HER-2 基因扩增模式。由于此情况多见,是本实验的研究对象?存在伴随着单个细胞内 17号染色体数目的翻倍而使 HER-2 表达相对增多的现象,即 17号染色体多倍化?强烈的信号刺激、上游存在强启动子等情况均可导致 HER-2 基因大量表达,尽管 HER-2 基因并不存在扩增?上述两种扩增模式极易导致 DNA 检测法(包括针对 DNA 的PCR 和FISH )产生假阴性结果。而 mRNA 检测尤佳方法设计?本文旨在验证数字 PCR 法对 HER-2 基因进行扩增检测的可行性, 同时与常规的荧光定量 PCR 法以及 FISH 检测结果作比较?对收集的样本进行 FISH 检测,作为 ddPCR 结果的参照?通过适当设计 HER-2 基因与参照基因的引物与探针,以多套组合进行 ddPCR ?与FISH 相同原理, HER-2 基因与对照基因的拷贝数比值(HER-2 /CEP17 )可反映 HER-2 基因的扩增状况?HER-2 受体结合区是生长因子-配体结合物、赫赛汀等靶向药物的作用位点之一,故引物主要设计在 HER-2 蛋白的受体结合区对应的基因序列,避免了 HER-2 基因融合、断裂等导致的假性结果?对照序列选择了 17号染色体着丝点附近的某一段固定的基因序列。 HER-2 基因的扩增数以该基因( 1个拷贝)为基准参照设计理念:更特异、更精准地检测 HER-2 基因的扩增