文档介绍：博士学位论文
(2010 届)
双调控溶瘤腺病毒携带超抗原 SEA 基因治疗前列腺癌基
础研究
Construction of binant adenovirus with double
promoters and SEA gene and study of its inhibition effect
on prostate carcinoma
研究生姓名贺厚光
指导教师姓名严春寅、韩从辉
专业名称泌尿外科
研究方向泌尿外科肿瘤
论文提交日期 2010 年 12 月
I
中文摘要双调控溶瘤腺病毒携带超抗原 SEA 基因治疗前列腺癌基础研究
双调控溶瘤腺病毒携带超抗原 SEA 基因治疗
前列腺癌基础研究
中文摘要
目的: 构建表达超抗原 SEA 基因的由前列腺特异性抗原(PSA)启动子及端粒酶
逆转录酶(hTERT)启动子双调控的特异性增殖溶瘤腺病毒 SG504-SEA。体外实验观
察 SEA 基因的表达及其刺激淋巴细胞对肿瘤的杀伤功能,及 SEA 促细胞因子分泌作
用。
方法: 从前列腺癌组织基因组 DNA 中获得 522bp 大小的 PSA 启动子序列,将 PSA
启动子克隆到由 hTERT 启动子调控的特异性增殖溶瘤腺病毒载体 SG502 中,得到靶向
前列腺癌细胞的双调控溶瘤腺病毒载体 SG504。将已构建好的含有 771bp 大小 SEA 基
因片段的病毒骨架质粒 db-SEA 与 SG504 用 Lipofectamine2000 共转染至 293
细胞。共转染后 9~14d 出现病毒空斑,经过三次病毒空斑纯化,经鉴定正确的腺病
毒命名为 SG504-SEA,即携带 SEA 基因的双调控靶向前列腺癌的特异性溶瘤腺病毒。
通过 RT-PCR 检测 SEA 在前列腺癌 DU145 细胞内不同时间段 mRNA 表达,分别于 12、
24、48h 提取细胞总 RNA 行 RT-PCR 检测 SEA 在核酸水平的表达量;将重组病毒以 5MOI
的滴度感染肿瘤细胞 DU145,分别于 12、24、48h 取出,免疫荧光定位 SEA 表达于前
列腺癌细胞;western blot 测定 SEA 蛋白表达;显微镜下动态观测淋巴细胞与前列
腺癌细胞共培养,ELISA 检测 TNF 和 IL-2 分泌。
结果: 经 PCR 及酶切鉴定,SEA 基因成功克隆到病毒载体中,可以表达 SEA 基因,
且病毒滴度为 ×1010pfu/ml。RT-PCR 检测 SG504-SEA 在肿瘤细胞内不同时段 mRNA
的表达,琼脂糖电泳 252bp 处可见清晰条带,转染前列腺癌 DU145 细胞在 12、24、
48 小时持续表达 SEA mRNA;免疫荧光定位 DU145 细胞表面可以看到明显的荧光表达,
可以确定 SEA 基因表达于前列腺肿瘤的细胞膜上,并且不同时段细胞表达荧光的亮度
存在差别,随着时间增加荧光表达逐渐增强;SDS-PAGE 电泳后用考马斯亮蓝染色显
示在 27kDa 附近可看到明显条带,而未转染细胞不存在。Western-blot 结果证实 SEA
蛋白的表达成功;淋巴细胞与肿瘤细胞共培养 12、24、48h 实验组肿瘤细胞明显少于
II
对照组,表明 DU145 细胞与淋巴细胞共同培养的过程中,转染 SEA 基因的肿瘤细胞相
对未转染的细胞更易被淋巴细胞捕获杀伤,对淋巴细胞有一定的趋化作用;ELISA 检
测 TNF 和 IL-2 分泌量实验组均高于对照组。
结论: 成功构建了表达超抗原 SEA 基因的双调控选择增殖型溶瘤腺病毒
SG504-SEA。证明其具有体外刺激淋巴细胞对前列腺癌细胞的杀伤作用,对肿瘤细胞
周围的细胞因子分泌存在促进作用。
【关键词】前列腺癌;超抗原 SEA;溶瘤腺病毒
作者:贺厚光
指导老师:严春寅
韩从辉
III
Construction of binant adenovirus with double
promoters and SEA gene and study of its inhibition effect
on prostate carcinoma
Abstract
Objective To construct double-regulated conditionally replicating adenovirus
SG504-SEA. SEA gene construct carrying the selective adenovirus. In vitro