文档介绍：生物化学实验讲义实验一蛋白质的性质实验——蛋白质及氨基酸的呈色反应及蛋白质的沉淀反应实验目的 1 .了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。 2 .了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。 3 .学****几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。 4 .加深对蛋白质溶液的胶体性质的认识,了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。, 一、茚三***反应 1. 实验原理除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三***反应产生黄色物质外, 所有α—氨基酸及一切蛋白质都能和茚三***反应生成蓝紫色物质。β- 丙氨酸、氨和许多一级***都呈阳性反应。尿素、马尿酸、二***吡唪和肽键上的亚氨基不呈现此反应。因此, 虽然蛋白质和氨基酸均有茚三***反应, 但能与茚三***呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸。在定性、定量测定中,应严防干扰物存在。该反应十分灵敏, 1∶1 500 000 浓度的氨基酸水溶液即能给出反应,是一种常用的氨基酸定量测定方法。茚三***反应分为两步, 第一步是氨基酸被氧化形成 CO 2、 NH 3 和醛, 水合茚三***被还原成还原型茚三***; 第二步是所形成的还原型茚三***同另一个水合茚三***分子和氨缩合生成有色物质。此反应的适宜pH为 5~7 , 同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH 条件下的颜色深浅不同, 酸度过大时甚至不显色。 2. 材料、仪器与试剂蛋白质溶液; 新鲜鸡蛋清溶液( 蛋清∶水=1∶9); % 甘氨酸溶液; % 茚三***水溶液; % 茚三***- 乙醇溶液 3. 实验操作①取2 支试管分别加入鸡蛋清溶液和 % 甘氨酸溶液 1ml , 再各加 % 茚三***水溶液,混匀,在沸水浴中加热 1~2 分钟,观察颜色由粉色变紫红色再变蓝。②在一小块滤纸上滴一滴 % 甘氨酸溶液,风干后,再在原处滴一滴 % 茚三***乙醇溶液,在微火旁烘干显色,观察紫红色斑点的出现。二、黄色反应 1. 实验原理含有苯环结构的氨基酸, 如酪氨酸和色氨酸, 遇***后, 可被硝化成黄色物质, 该化合物在碱性溶液中进一步形成橙黄色的硝醌酸钠。多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸, 所以有黄色反应, 苯丙氨酸不易硝化, 需加入少量浓硫酸才有黄色反应。 2. 材料、仪器与试剂鸡蛋清溶液;大豆提取液( 将大豆浸泡充分吸胀后,研磨成浆状用纱布过滤) ;头发;指甲; % 苯酚溶液;浓***; % 色氨酸溶液; % 酪氨酸溶液; 10% 氢氧化钠溶液 3. 实验操作向7 个试管中分别按下表加入试剂, 观察各管出现的现象, 有的试管反应慢可略放置或用微火加热。待各管出现黄色后, 于室温下逐滴加入 10% 氢氧化钠溶液至碱性, 观察颜色变化。管号1234567 材料(滴) 鸡蛋清溶液 4 指甲少许头发少许 % 色氨酸 4 % 酪氨酸 4 浓***/ (滴) 24 40 40444 现象三、蛋白质沉淀反应蛋白质是亲水胶体, 当其稳定因素被破坏或与某些试剂结合成不溶性盐类后, 即自溶液中沉淀析出,此现象叫蛋白质的沉淀反应。(一)蛋白质的盐析作用 1. 实验原理盐析现象是指—般蛋白质在高浓度盐溶液中溶解度下降, 故向其溶液中加入中性盐至一定浓度时, 蛋白质即自溶液中沉淀析出。盐析作用与两种因素有关:①蛋白质分子被浓盐脱水; ②分子所带电荷被中和。蛋白质的盐析作用是可逆过程, 用盐析方法沉淀蛋白质时, 较少引起蛋白质变性, 经透析或用水稀释时又可溶解。盐析不同的蛋白质所需中性盐浓度与蛋白质种类及 pH 有关。分子量大的蛋白质( 如球蛋白) 比分子量小的( 如清蛋白) 易于析出。球蛋白在半饱和硫酸铵溶液中即可析出,而清蛋白需在饱和硫酸铵溶液中才能析出。 2. 材料、仪器与试剂鸡蛋清溶液( 蛋清∶水=1∶9); 固体硫酸铵; 饱和硫酸铵溶( 称取 377 g 硫酸铵溶于 20 ℃ 500ml 的蒸馏水中。硫酸铵在 20℃水中的溶解度为 754g/L 水。配制时需称取稍过量的硫酸铵使溶液中有少量固体存在,同时可加热助溶)。 3. 实验操作取鸡蛋清溶液约 5 ml 于试管中,再加入等量的饱和硫酸铵溶液,混匀后静止数分钟则析出球蛋白沉淀。将管内混合液过滤, 向滤液中加入硫酸铵粉末, 至硫酸铵饱和不再溶解为止,此时析出的沉淀为清蛋白。(二)重金属盐类沉淀蛋白质 1. 实验原理溶液 pH 在蛋白质等电点以上时,重金属盐类(如 Pb 2+、 Cu 2+、 Hg 2+及 Ag+等) 易与蛋白质结合成不溶性盐而沉淀。重金属盐类沉淀蛋白质通常比较完全, 故常用重金属盐除去液体中的蛋白质。但应注意,在使用某些重金属盐( 如硫酸铜或醋酸铅) 沉淀蛋白质时, 不可过量,否则将引起沉淀再溶解。 2. 材料、仪器与试剂鸡蛋清溶液(蛋清∶水=1∶9);5% CuS04 溶液; 3% AgNO3 溶液 3.