文档介绍：货号:MS1501规格:100管/96样过氧化氢酶(Catalase,CAT)试剂盒说明书微量法正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定测定意义:CAT()广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是最主要的H2O2清除酶,在活性氧清除系统中具有重要作用。测定原理:H2O2在240nm下有特征吸收峰,CAT能够分解H2O2,使反应溶液240nm下的吸光度随反应时间而下降,根据吸光度的变化率可计算出CAT活性。自备实验用品及仪器:紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板(UV板)、研钵、冰和蒸馏水试剂组成和配制:提取液:液体100mL×1瓶,4℃保存;工作液:液体24mL×1瓶,4℃保存;粗酶液提取:1、细菌、细胞或组织样品的制备:细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g4℃离心10min,取上清,置冰上待测。组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g4℃离心10min,取上清,置冰上待测。2、血清(浆)样品:直接检测。测定步骤:分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至240nm,蒸馏水调零。测定前将CAT检测工作液在37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴10min以上。准备96孔UV板一块(非普通酶标板,普通酶标板只能透过可见光,不能透过紫外光,检测波长小于340nm务必使用UV板)。在微量石英比色皿或96孔UV板中加入10μL样本和190μL工作液,混匀,记录240nm下初始吸光值A1和1min后的吸光值A2。计算ΔA=A1-A2。CAT活性计算:、血清(浆)CAT活力的计算:单位的定义:每毫升血清(浆)每分钟催化1nmolH2O2降解定义为一个酶活力单位。CAT(nmol/min/mL)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷V样÷T=459×ΔA2、组织、细菌或细胞中CAT活力计算:(1)按样本蛋白浓度计算:单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化1nmolH2O2降解定义为一个酶活力单位。CAT(nmol/min/mgprot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T=459×ΔA÷Cpr(2)按样本鲜重计算:单位的定义:每g组织每分钟催化1nmolH2O2降解定义为一个酶活力单位。CAT(nmol/min/g鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W×V样÷V样总)÷T=459×ΔA÷W(3)按细菌或细胞密度计算:单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟催化1nmolH2O2降解定义为一个酶活力单位。CAT(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=×ΔAV反总:反应体系总体积,2×10-4L;ε:H2O2摩尔消光系数,×104L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,;V样