文档介绍：河北医科大学
博士学位论文
阿克拉霉素与顺铂合用对卵果癌细胞抑制机理研究
姓名:阴梅云
申请学位级别:博士
专业:人体解剖与组织胚胎学
指导教师:阎蕴力
阿克拉霉素与顺铂合用对卵巢癌细胞的抑制机理研究摘要目的卵巢癌化疗中,顺铂。τ闷毡椋喙抗药性问题也越来越突出。因此,选择能有效与之配伍的药物是临床探索的问题之一。阿克拉霉素,作为拓扑异构酶种萍林唬诼殉舶┑闹瘟浦惺褂媒少,并且与合用时相互作用机理尚不明确。为此,本研究通过隒:嫌靡┑奶逋馐笛椋荚谔教致殉舶┗埔┪组合,为筛选有效抗肿瘤药物提供依据。材料和方法牧卵巢浆液性囊腺癌赴暌员本┐笱嗣褚皆骸I钲谕蚶忠┮涤邢薰静贰@ッ魅纸鹗粢┮涤限公司产品。免疫细胞化学试剂,一抗为鼠抗人抗体拦公司备趸锩标记的生物素化二抗购自武汉博海生物公司。.培养基、噻唑蓝酶、蛋白酶⒅蟹肿恿康白员曜肌⑦灌こ取⑿嵋亦す鹤曰C拦尽椒细胞培养和药物作用浓度选择赴訰嘌嘌诤バ律QG濉青霉素痬⒘疵顾畉∥,置℃、环境下培养。应用药物的血浆峰浓度琍渲痬邢嘤κ笛榉肿椤椒ḿ觳庖┪锒韵赴囊种坡取指数生长期细胞,以/细胞浓度接种于孔培养板斗,加入无血清培养液稀释的药物J笛樽榻獳的ǘ痬分别与的浓度痬、。同时设对照样品。不同药物及浓度均为纯住R┪镉胂赴餐嘌,每孔加中文摘要痬籆痬、,
入痬<绦跤小时后,离心吸去上清,加入譊罩狗从ΑS妹副暌遣波长吸光值似值<扑阋种坡剩唇鹗瞎椒治鯝与合用对卵巢癌细胞抑制效应。本实验重复巍双荧光染色观察凋亡细胞将细胞与药物共同作用螅/胄分钟,悬浮于磷酸缓冲液中。配制吖啶橙和嗅乙啶各为/的混合染液。加荧光染液于细胞悬液内,吹打混匀、滴至载玻片上,置荧光显微镜下观察,每个样品定量计数鱿赴0垂剑旱蛲鱿胞数/总细胞数×ィ扑愕魍雎剩冒唇鹗瞎椒治鍪笛榻克隆抑制率检测将细胞按/浓度接种于培养瓶。细胞进入指数生长期后加入药物,每组均为鍪笛槠俊R┪镉胂赴餐跤后,消化细胞,无血清培养液清洗。按痬赴尤嘌皿培养。⌒成数。按公式:寺⌒纬墒又窒赴×ィ扑憧寺抑制率,按金氏公式分析结果。崛〖暗缬药物与细胞共孵育@胄氖占赴尤胂赴呀庖海裂解>璕酶痬作用,蛋白酶℃作用。。行%琼脂糖凝胶电泳。紫外透射仪观察、记录。蛋白印迹分析表达收集各组细胞经磷酸盐缓冲液洗涤后,加入だ湎赴解液裂解>鞍锥亢螅芳尤氲攘可涎缓冲液,经%电泳后,用半干式电转移仪转至硝酸纤维素膜上。加入一抗,鼠抗人抗体跤埂Q蚩故驢标记二抗,℃孵育6被1桨显色后分析结果。免疫细胞化学检测泛素表达中文摘要果。/./畉畉
结果表明,隒哂忻飨缘男вΑ药物作用后离心收集细胞、经ザ嗑奂兹┕潭ê螅沃镣坑多聚左旋赖氨酸的载片上。用冷逑础%甲醇过氧化氢室温孵育獗展趸锩浮%过夜。冷逑遍,巍J:心ド窖蜓G宸跤。滴加.∈一抗,小鼠抗人泛素单克隆抗体,于湿盒内跤埂F浜驪清洗三次,’/次;滴梗羊抗小鼠生物素.∈,湿盒内温育逑春螅渭:∈∈昙堑那缀退兀温育5渭覦显色。苏木精复染,常规脱水、透明、封片、显微镜下观察记录。结果觳饨峁应用觳饪杉篈单独作用后对卵巢癌抑制率为.±%,单独用药依据作用浓度的不同,±%,痬±%,而与餐饔煤螅湟种坡史直鹛岣呶±%、..ァ±。以上结果用金氏公式分析两药的合并效应,ü馊旧ü鄄煜赴蛲将药物与细胞共同作用后,经吖啶橙、嗅乙啶双荧光染色观察可见:正常细胞呈绿色,依据常染色质和异染色质不同,荧光密度有所差异。凋亡细胞或可见凋亡小体,中晚期凋亡细胞呈橘红色或红色、染色质凝集、染色均匀,细胞核变小。计算各组细胞凋亡率,结果表明:虲嫌糜胍┪锏ビ孟啾龋赴蛲雎拭飨增加。┪锒韵赴寺∫种坡实挠跋为判断不同药物作用后细胞的生存能力,细胞经药物作用后,连续培养欤鄄煜赴目寺⌒纬汕榭觥=峁杉孀潘靡物的不同,细胞形成的集落大小不等。对照组细胞一个集落内的细胞数平均超过个细胞;而经药物作用后,一个集落内细胞数在个不等。本实验将大于个细胞的集落定为一个克隆。计算中文摘要,,
不同药物组克隆抑制率,显示痬ǘ认拢寺∫种率为..ィ籆痬ǘ认拢寺∫种坡饰±甇%;以上两药合用使克隆抑制率达ァ碇悄旱缬炯觳饨峁观察药物作用后对细胞狭训挠跋欤碇悄旱缬显示:虲嫌糜肓揭┑ビ孟啾龋杉韵赴鸇损伤明显增加,并断裂成小分子片段。鞍子〖7治鰐泶蛋白印迹分析表明,殉舶┫赴泶镉衪两种同功酶。观察药物单独应用对细胞内表达的影响,可见细胞经ザ雷饔煤螅芄煌币种苩蛅的表达,并对囊种谱饔酶俊O赴瑿单独作用后表达均明显增加。隒合用可明显减少蛅谋泶铮渲卸詔泶的抑制效应更为显著。┪锒苑核乇泶锏挠跋各组细胞经免疫细胞化学染色显示泛素的表达情况,结果可见:细胞经药物作用后呈弱阳性、阳性和强阳性反应以区分泛素表达程