文档介绍：流感病毒的快速检测方法
一、RT-PCR快速诊断方法
（一）生物安全要求
（二）病毒核酸提取
（三）RT-PCR
（四）PCR产物纯化
（五）流感病毒RT-PCR检测引物
二、免疫荧光方法检测流感病毒
一）
原理
二）
此循环的反应条件仅共参考，如果引物更换相应的反应条件需要做适当调整。
t
60C
1
min
t
42C
10
min
t
50C
30
min
t
95C
15
min
t
94C
30
sec
t
52C
30
sec
t
72C
1
min
t返回第5部，循环34次
t72°C10min
t4C保存
4)PCR产物检测
琼脂糖凝胶配置：%〜%溶液，加热使之完全溶解。冷却到50〜60C时加入溴化乙锭(EthidiumBromideEB,10ug/pl),|jg/ml。
PCR产物检测：将凝胶放入电泳槽，加入IxTBEBuffer，使它淹没过胶面。每份标本取4》lPCR产物，与1pl5xLoadingBuffer充分混匀后全加入凝胶孔中。于同一凝胶的第一孔加入5pl分子量标准样品。加完样后，盖上电泳槽盖子,接通电源，稳压100v，电泳时间约30〜40min。
结果分析:用UV〜254暗箱式紫外透射仪观察电泳结果，在透射波长254nm下观察结果效果较好。或者用凝胶成像系统观察电泳结果。
5)注意事项：含EB的琼脂糖经处理后放入科研垃圾袋内统一处理。含有EB的凝胶处理方法：
,小心混匀。
,小心混匀。于室温放置数小时。,小心混匀后即可丢弃。
)))))))))
)123456789
二步法RT-PCR实验材料
逆转录酶：AMVReverseTranscriptase,Catalog#
Rnaseinhibitor40u/口丨(Promega)
上游引物200ng/口丨
下游引物200ng/口丨
无RNA酶的水(RnaseFreeWater)
Ex-Taq酶5u/口丨DRR001A250u(Takara)10XPCRBuffer
（2）实验步骤
1）逆转录反应（在清洁区缓冲间，加RNA模板在核酸提取室）
无RNA酶的水

5XRTBuffer
4口丨

2口
上游引物
1口丨
Rnaseinhibitor

逆转录酶
1口丨
RNA模板
5口丨
总量：20口丨
将上述反应液混匀，42°C水浴作用1小时。然后94°C3min,放置冰上（下步PCR反应或-20C待用）
2）PCR反应配置（在清洁区缓冲间，加cDNA模板应在PCR扩增室）

10XPCRBuffer5口丨

上游引物1口丨
下游引物1口丨
Ex-
cDNA模板5口丨
总量：50口丨
3）将PCR反应管放入PCR扩增仪
4）PCR反应条件：此循环的反应条件仅共参考，如果引物更换，相