文档介绍：流感病毒的快速检测方法
一、 RT-PCR快速诊断方法
（一） 生物安全要求
（二） 病毒核酸提取
（三） RT-PCR
（四） PCR产物纯化
（五） 流感病毒RT-PCR检测引物
二、 免疫荧光方法检测流感病毒
（一）
PCR反应配置(在清洁区缓冲间，加RNA模板应在核酸室)
无 RNA 酶水(Rnase Free Water)
|jl
5xBuffer
10|jI
10mM dNTP
2pl
Enzyme Mix
2pl
Rnase inhibitor
|jl
上游引物
1|j|
下游引物
1|j|
RNA模板
5|jl
总量:
50|jl
2)
将PCR反应管放入PCR扩增仪
3)
RT-PCR反应条件：此循环的反应条件仅共参考，如果引物更换,
相应的反应条件需要做适当调整。
一
60 °C
1 min
一
42 °C
10 min
一
50 °C
30 min
一
95 °C
15 min
一
94 °C
30 sec
一
52 °C
30 sec
一
72 °C
1 min
一
返回第
5部，循环34次
一
72 °C
10 min
一
4 °C
保存
4) PCR产物检测
琼脂糖凝胶配置：%〜%溶液，加热使之完 全溶解。冷却到50-60°C时加入漠化乙锭(Ethidium Bromide EB, 10ug/pl), |jg/ml。
PCR产物检测：将凝胶放入电泳槽，加入1xTBE Buffer，使它淹没过胶面。 每份标本取4pl PCR产物，与却1 5xLoading Buffer充分混匀后全加入凝胶孔 中。于同一凝胶的第一孔加入55分子量标准样品。加完样后，盖上电泳槽盖子, 接通电源，稳压100v,电泳时间约30〜40min。
结果分析:用UV-254暗箱式紫外透射仪观察电泳结果，在透射波长254nm 下观察结果效果较好。或者用凝胶成像系统观察电泳结果。
5)注意事项：含EB的琼脂糖经处理后放入科研垃圾袋内统一处理。
含有EB的凝胶处理方法：
t KMnO4,小心混匀。
t mol/LHCl/h心混匀。于室温放置数小时。
t mol/L NaOH,小心混匀后即可丢弃。
二步法 RT-PCR
实验材料
\—/ \)/ \)/ \)/ \)7 \)7 \)7 \)7 \)/ 123456789
逆转录酶：AMV Reverse Transcriptase, Catalog# M5101 Paromeg
5X RT Buffer
dNTP
Rnase inhibitor 40u/ u I (Promega)
上游引物 200ng/ u I
下游引物 200ng/ u I
无 RNA 酶的水(Rnase Free Water)
Ex-Taq 酶 5u/u I DRR 001A250u (Takara)
10XPCR Buffer
实验步骤
逆转录反应(在清洁区缓冲间，加RNA模板在核酸提取室)
无RNA酶的水
ul
5X RT Buffer
4 ul
dNTP
2 ul
上游引物
1 ul
Rnase inhibitor
ul
逆转录酶
1 ul
RNA模板
5ul
总量：20 E
将上述反应液混匀，42°C水浴作用1小时。然后94°C 3min ,放置冰上（下 步PCR反应或-20°C待用）
2） PCR反应配置（在清洁区缓冲间，加cDNA模板应在PCR扩增室）
无RNA酶的水 ul
10 X PCR Buffer 5 u I
dNTP 2 u I
上游引物 1ul
下游引物 1E
Ex-Taq 酶 u I
cDNA 模板 5 ul
总量：50 u I
3） 将PCR反应管放入PCR扩增仪
4） PCR反应条件：此循环的反应条件仅共参考，如果引物更换，相应
的反应条件需要做适当调整。
一
94 °C
3
min
一
94 °C
40
sec
一
52 °C
40
sec
一
72 °C
2
min
一
返回第2部,
循环30次
一
72 °C
7
min
一
4 °C
保存
t PCR产物检测：同一步法
PCR产物纯化
实验材料
QIAquick Gel Extractio