文档介绍：合肥工业大学
硕士学位论文
重组大肠杆菌右旋糖酐蔗糖酶表达条件优化及其催化合成右旋
糖酐的研究
姓名:王雅洁
申请学位级别:硕士
专业:生物化工
指导教师:张洪斌
20090301
重组大肠杆菌右旋糖酐蔗糖酶表达条件优化及其催化合成右旋糖酐的研究摘要右旋糖酐蔗糖酶..能以蔗糖为底物,将咸烟腔R频秸在增长的葡聚糖链上形成高分子的葡萄糖聚合物右旋糖酐。右旋糖酐在医药、化工、食品工业中都有重要的用途。工业生产右旋糖酐是发酵肠膜状明串珠菌,通过加入蔗糖诱导产生右旋糖酐蔗糖酶。因为在原菌株中分离该酶比较困难不利于研究该酶的催化性质,本实验将右旋糖酐基因克隆到大肠杆菌中并表达。本研究分别以毂籇一硫代半乳糖苷腿樘俏S盏嘉铮过设计正交实验,考察培养基中各成分及其浓度对诱导产酶结果的影响,成功选择了适合不同诱导物可高效表达该酶的两种表达培养基。在选择了合适的培养基之后,分别研究诱导条件的影响。用诱导时,其最佳条件为℃菌浓达到时,加入至疞继续诱导培养。用乳糖诱导时,其最佳条件为菌浓,加入乳糖至%继续诱导培养。从结果来看,乳糖诱导效果不及的五分之一,但是对于工业生产乳糖诱导的低价和无毒则更工程菌经过诱导后生产含畉融合蛋白的右旋糖酐蔗糖酶,通过硫酸铵沉淀、.缀筒阄龃炕玫酱慷冉细叩拿傅鞍祝⒍源棵附了酶学性质及动力学研究。经过甈獾酶妹傅姆肿恿吭嘉与理论推测值基本相同。以蔗糖为底物,酶促反应的最适温度为~℃,最适值为,,在室温保藏烊杂サ拿富盍Γ。4周酶活力仅下对催化作用有较大的促进,有微弱的促进作用,和囊种谱饔米钋俊研究利用表达的重组右旋糖酐蔗糖酶以蔗糖为底物合成右旋糖酐,探讨温度、蔗糖浓度和值对合成糖酐的影响。结果表明,底物转化率超过%,合成的糖酐多为大分子但溶解性很好。蔗糖浓度对右旋糖酐产率的影响最大,其次是温度,影响最小的是值。研究对该酶合成右旋糖酐的分子量控制和水解、乙醇划分进行了一些初步的研究,为该重组右旋糖酐蔗糖酶纯酶进行催化反应和工业化应用提供了重要参数。关键词:右旋糖酐蔗糖酶;表达;;乳糖:纯化;右旋糖酐有价值。/幻富钤趐甇~较为降一半,但在℃以上失活很快;疞/
。⋯..琈,.℃琣/%..ィ甌瑆甌℃妫甌%%猤瓺,.瓸,..瑆,甀,甴甀瑆.,—一』、一‘■‘●●
,/,什.%,.瓹瑃瓵瑃琭琣琩::;;籶籨
图卜图诱导菌浓与诱导时间对表达酶活的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯培养基中温度对乳糖诱导酶活的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯对酶活力的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯图酶的最适反应温度和热稳定性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯..图乌氏粘度计示意图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯图右旋糖酐刁/图谱⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯..图右旋糖酐刁/图谱⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯..插图清单图重组表达质粒籨的构建图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯ú舛ü呛勘曜记摺⋯⋯⋯..图工程菌在、表达培养基中的生长曲线⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯图破碎时间对酶活的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯..培养基中乳糖浓度对诱导酶活的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯图工程菌在不同诱导物下的生长过程⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯.图最优培养基中菌体生长曲线⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯.图优化培养基中菌浓对表达酶活的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯..痬鞍兹芤罕曜记摺痬鞍兹芤罕曜记摺图酶的表达与纯化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯..图酶的温度稳定性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯..图蔗糖浓度和反应速度的双倒数曲线⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯.图反应温度对合成糖酐的影响产率;特性黏度。⋯⋯⋯⋯图蔗糖浓度对合成糖酐的影响产率:特性黏度。⋯⋯⋯⋯值对合成糖酐的影响产率;特性黏度。⋯⋯⋯⋯⋯.图
表格清单表实验试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯.表实验设备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯.表正交实验因素水平表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯..表正交实验表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯..表果糖浓度与对应吸光度⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯表正交实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯浓度对表达酶活的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯.表破碎时间对酶活的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯表正交实验优化培养基结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯..痬鞍兹芤号渲啤痬鞍兹芤号渲啤痬鞍兹芤合陨舛取痬鞍兹芤合陨舛取⋯⋯⋯..表金属离子和其他化合物对酶活力的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯表右旋糖酐分级沉淀⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯.表麦芽糖对合成产物的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯.表两种反应体系中酶活研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯.表两种反应体系中果糖生成浓度研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯.表右旋糖酐分子量分布⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯..表麦芽糖对合成糖酐的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯.表转速对合成糖酐相对黏度的影响⋯⋯⋯