文档介绍：山东大学·细胞生物学实验报告·吴宏宇· 201100140177 小鼠脾脏原代细胞培养与细胞死活鉴定和计数一、实验目的 1. 学****掌握细胞培养的基本原理及具体操作方法,并对小鼠脾细胞进行原代培养 2. 掌握并熟悉无菌操作的要点,并养成无菌操作的****惯 3. 学****用染色法鉴别细胞死活并进行细胞计数 4. 学会利用血球计数板对细胞总数和活细胞进行计数二、实验原理①细胞培养: 多细胞生物的细胞可以被分离出来, 然后在体外特殊培养环境中继续存活, 并保持其生理、生化特性直接从生物体分离出来, 在体外培养过程中尚未分裂、增殖的细胞, 称为原代培养细胞。原代培养细胞在一定条件下可以继续增殖, 在数量上大量扩增, 这时就成为继代培养细胞。细胞培养基要满足细胞的生长需要, 培养细胞的条件有水的质量、无菌环境, 最适温度、渗透压、气体条件、最适 PH 、营养条件和培养基质等。细胞培养皿是特殊制造的使细胞可以贴壁。细胞培养箱常指二氧化碳培养箱。它可以提供合适的温度和二氧化碳浓度。二氧化碳和培养基中的缓冲系统共同作用,保持细胞培养液的酸碱度。超净台通过将空气进行过滤,为细胞培养的各种操作提供了一个干净的环境,使细胞培养免于细菌和真菌的污染。②细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法: 活细胞和死亡细胞在生理技能和性质上主要存在一下差异: I. 细胞膜通透性的差异:活细胞的细胞膜是一种选择性膜,对细胞起保护和屏障作用, 只允许物质选择性地通过; 而细胞死后, 细胞膜受损, 其通透性增加。基于此, 发展出了以台盼蓝、伊红、苯***黑、赤藓红、***蓝以及荧光染料碘化丙啶或溴化乙啶等为染料鉴别细胞生死状态的方法,上述染料能使死亡细胞着色,而活细胞不被着色。 II. 代谢上的差异:活细胞中新陈代谢作用强,细胞内的酶具有较强的活性和还原能力。基于此,发展处了以荧光素二乙酸酯( FDA ) 、荧光素二丙酸酯、荧光素二丁酸酯或荧光素二苯甲酰酯等酯化的荧光素鉴别细胞生死状态的方法, 上述酯化的荧光素亲脂性提高, 容易被细胞吸收进入, 活细胞内的酯酶具有较强的活性, 可将酯化的荧光素分解而释放出能发荧光的荧光素, 该物质不能自由透过活的细胞膜, 积累在细胞内, 荧光显微镜下显示有明亮的绿色或黄绿色荧光; 而死亡细胞内的酯酶因失去活性, 不能分解酯化的荧光素, 荧光显微镜下显示不发光。另外, 可用亚***蓝为染料鉴定酵母细胞的生死状态。亚***蓝是一无毒染料, 氧化型为蓝色, 还原型为无色。活细胞因具有较强的还原能力, 能使亚甲蓝从蓝色的氧化型变成无色的还原型, 故活的酵母细胞在用亚***蓝染色后显示无色; 死亡酵母细胞或代谢缓慢的衰老酵母细胞, 因无还原能力或还原能力极弱, 使亚甲蓝仍处于氧化态, 故呈现蓝色或淡蓝色。山东大学·细胞生物学实验报告·吴宏宇· 201100140177 活细胞必需通过控制物质进出细胞膜来保持内部生理环境的稳定性。细胞死后细胞膜通透性发生改变, 原先不能进入细胞的物质也能够进入细胞。台盼蓝染料正常情况下被活细胞阻拦在细胞膜外, 只有细胞膜受损或者细胞死亡后, 才能进入细胞。因此, 活细胞一般不能被台盘蓝染色,而死细胞会被染成蓝色。伊红和苏木精是最常用的细胞染色剂。本次实验就是用这两个染色剂进行的。③血球计数板的使用: 血球计数板是一块特制的厚载玻片, 载玻片上有 4