文档介绍：试验二热休克蛋白HSP90PCR扩增技术一、试验目标和原理介绍聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)是体外克隆基因关键方法,它可在多个小时内使模板分子扩增百万倍以上。所以能用于从微量样品中取得目标基因,同时完成了基因在体外克隆,是分子生物学及基因工程中极为有用研究手段。常规PCR用于已知DNA序列扩增,具体可分为三个关键过程:一、变性。经过升高温度使DNA双链模板分子中氢断裂,形成单链DNA分子,温度为94℃,时间1min。二、复性。降低温度使DNA单链分子同引物结合。温度为55℃,时间1min。三、延伸。升高温度,在DNA聚合酶最好活性条件下在引物3端加入dNTP,实现模板扩增,温度为72℃,时间2min。同时第一步变性前要在94℃下预变性5分钟,使DNA双链完全解开。经过25-35个循环以后,在72℃下继续延伸10分钟。PCR反应包含七种基础成份:热稳定性DNA聚合酶:TaqDNA聚合酶是最常适用酶,商品化TaqDNA酶特异性活性约为80000单位/:寡核苷酸引物设计是影响PCR扩增反应效率和特异性关键原因。脱氧核苷三磷酸(dNTP):标准PCR反应体系应包含4种等摩尔浓度脱氧核苷三磷酸,即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。每种dNTP浓度通常在200-250μl之间,高浓度dNTP对扩增反应会起抑制作用,可能是dNTP和Mg2+螯合相关。二价阳离子:通常需要Mg2+来激活热稳定DNA聚合酶,因为dNTP和寡聚核酸结Mg2+合,所以反应体系中阳离子浓度通常要超出dNTP和引物起源磷酸盐基团摩尔浓度。Mg2+。维持PH值缓冲液:用Tris--,标准PCR缓冲液浓度在10mmol/L。在72℃温育时,反应体系温度将下降1个多单位,。模板DNA:含有靶序列模板DNA能够以单链或双链形式加入到PCR混合液中,闭环DNA及增效率略低于线性DNA。试验目标:学****PCR反应基础原理和基础技术。二、材料和试剂10Х扩增缓冲液4种dNTP贮存液(20mmol/L,)TapDNA聚合酶5端引物(20μmol/L)及3端引物(20μmol/L)模板DNA琼脂糖凝胶移液枪(-10μL5-50μL)枪头试验操作将各成份加到微量离子管内混合::预变性:96ºC5min30个循环:95ºC45min,60ºC45min,72ºC150min;延伸:72ºC10min注:聚合反应时间是依据靶基因长度按每分钟聚合1000bp速率来计算出来。抽取每种扩增样品5-10μl,用琼脂糖电泳来分析扩增结果,用DNAmarker来判定扩增片段大小。凝胶通常见Goldview染色后观察扩增量和片段大小。从阳性对照样品相对分子量目标条带亮度和粗细能够判定PCR扩增效率;阴性对照样品在目标条带周围应该没有对应条带。PCR常见问题及处理方案试验注意事项:对可能发生PCR过程中关键疑难问题解析问题可能原因处理方法无产物或产量低模板浓度偏低或偏高电泳检测模板浓度,调整模板用量模板降解重新制备